3525　人粒细胞刺激因子生物学活性测定法 （NFS-60细胞/MTT比色法）

本法系依据人粒细胞刺激因子（G-CSF）可刺激小鼠骨髓白血病细胞（NFS-60细胞）的增殖，通过比较G-CSF标准品与供试品对NFS-60细胞刺激增殖的作用，来测定供试品中G-CSF的生物学活性。

试剂　（1）RPMI 1640培养液　取RPMI 1640培养基粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素10⁵IU和链霉素10⁵IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，经0.22μm滤膜滤过，即得，4℃保存。也可采用经验证的商品化试剂。

（2）基础培养液　取RPMI 1640培养液900ml，加新生牛血清或胎牛血清100ml，混匀，4℃保存。

（3）完全培养液　取基础培养液适量，加人粒细胞刺激因子制成每1ml中含人粒细胞刺激因子10～20ng的培养液。

（4）磷酸盐缓冲液（PBS）　取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g与磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。

（5）噻唑蓝（MTT）溶液　取MTT 0.10g，加PBS 20ml使溶解，经0.22μm滤膜滤过，即得。4℃避光保存。

（6）裂解液　取盐酸14ml、Triton X-100 50ml，加异丙醇稀释至500ml。室温避光保存。也可采用其他经验证的裂解液。

标准品溶液　取人粒细胞刺激因子生物学活性测定标准品，按说明书复溶后，用基础培养液稀释至每1ml中约含1200IU或适宜浓度。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释（系列稀释的稀释倍数可根据细胞状态进行适当调整），共8个稀释度，每个稀释度重复3孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。

供试品溶液　取供试品，按标示量用基础培养液稀释至每1ml中约含1200IU或适宜浓度。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释（必要时照标准品溶液项下适当调整），共8个稀释度，每个稀释度重复3孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。

测定法　NFS-60细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下按下表推荐方式进行培养。也可采用其他经验证的培养方式。

将试验所用溶液预热至37℃。取足量NFS-60细胞培养物，离心收集NFS-60细胞，用RPMI 1640培养液洗涤3次，再用基础培养液重悬，制成每1ml中含2.0×10⁵个细胞的细胞悬液，置37℃备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液50μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养40～48小时。每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。每孔加入裂解液100μl，混匀后，用酶标仪在参比波长630nm，检测波长570nm处测定吸光度。

以标准品或供试品溶液对数浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，照生物检定统计法（通则1431）中的四参数回归计算法进行试验数据处理，计算供试品生物学活性及95%置信区间：

式中　P_r为标准品生物学活性，IU/ml；

D_s为供试品预稀释倍数；

D_r为标准品预稀释倍数；

E_r为约束模型中标准品的50%效应浓度；

E_s为约束模型中供试品的50%效应浓度。

试验有效标准：标准品和供试品的四参数剂量反应曲线应当完整，上、下渐近线应各至少包含一个浓度点，线性部分应至少包含两个浓度点。标准品和供试品的剂量反应曲线的上下渐近线比值应不小于3，决定系数（R²）应不小于0.98，可靠性测验中回归项应非常显著（P<0.01）、偏离平行项应不显著（P≥0.01）。供试品生物学活性的95%置信区间应在测得生物学活性的74%～136%。

注：显色方法也可采用经等效验证的其他显色方法。