冻干b型流感嗜血杆菌结合疫苗

Donggan b Xing Liuganshixueganjun Jiehe Yimiao
Haemophilus Influenzae Type b Conjugate Vaccine，Freeze-dried

本品系用纯化的b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b，Hib）荚膜多糖抗原，即多聚核糖基核糖醇磷酸酯[PRP，由3-β-D-呋喃核糖基-（1→1）-核糖醇-5-磷酸酯盐为重复单元形成的具有一定分子量范围的线性聚合物]，经活化并通过己二酰肼与载体蛋白破伤风类毒素共价结合生成的多糖蛋白结合物，加入适宜稳定剂后冻干制成。用于预防b型流感嗜血杆菌引起的儿童感染性疾病，如脑膜炎、肺炎等。

1　基本要求

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2　制造

2.1　菌种

生产用菌种应符合生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制（通则0233）的有关规定。

2.1.1　名称及来源

采用b型流感嗜血杆菌CMCC 58534株或其他经批准的菌种。

2.1.2　种子批的建立

应符合生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制（通则0233）的有关规定。

2.1.3　种子批的传代

主种子批启开后传代次数不超过5代；工作种子批启开后至接种发酵罐培养传代次数不得超过5代。

2.1.4　种子批的检定

检定菌种可用含羊血的适宜培养基。

2.1.4.1　培养特性

菌种在普通营养琼脂培养基上不生长，在含羊血的巧克力培养基或在Hib综合琼脂培养基上生长，生长需要Ⅹ因子（氯化血红素）和Ⅴ因子（辅酶Ⅰ）；卫星试验阳性；菌落呈灰白色、半透明、光滑凸起，湿润，边缘规则。

2.1.4.2　染色镜检

应为革兰阴性短小杆菌，有荚膜，有时连成线状，亦可有单个革兰阴性球菌。

2.1.4.3　生化反应

发酵葡萄糖、木糖、半乳糖，产酸、不产气。不发酵蔗糖、乳糖和果糖（通则3605）。赖氨酸脱羧酶反应呈阴性。或按经批准的方法进行检定。

2.1.4.4　血清学试验

将在35～37℃培养的菌苔，与Hib免疫血清进行玻片凝集试验，应有强凝集反应。

2.1.5　种子批的保存

种子批应冻干保存于8℃以下。或应符合批准的要求。

2.2　原液

2.2.1　生产用种子

启开工作种子批菌种，经适当传代检查培养特性和染色镜检后接种在适宜培养基上，制备数量适宜的生产用种子。

2.2.2　生产用培养基

采用Hib综合培养基或经批准的其他适宜培养基。

2.2.3　培养

采用发酵罐液体培养，在培养过程中取样进行纯菌检查、涂片革兰染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。

2.2.4　收获及杀菌

于对数生长后期或静止期前期收获，取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，然后于培养物中加入适宜浓度的甲醛溶液或采用适宜的方法杀菌，以确保杀菌完全及不损伤Hib荚膜多糖为宜。

2.2.5　精制多糖制备与检定

2.2.5.1　复合多糖制备

将已杀菌的培养物离心去菌体，收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶液并充分搅拌使多糖与CTAB形成复合多糖沉淀，离心或采取其他适宜方法收集含复合多糖的沉淀。

2.2.5.2　粗制多糖制备

在含复合多糖的沉淀中加适量盐溶液，采用振荡或其他方式使多糖与CTAB充分解离，加适量乙醇，混匀并静置适宜时间，离心，收集上清液，加适量乙醇并充分振摇使多糖沉淀，离心并收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物，干燥后即为粗制多糖。或采用其他经批准的方法。可-20℃或以下保存。

2.2.5.3　精制多糖制备

将粗制多糖溶解于醋酸钠溶液中，苯酚抽提，离心并收集上清液；用超滤或其他适宜方法去除苯酚等小分子杂质，加乙醇溶液使多糖沉淀，离心并收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥，所得固体即为精制多糖。或采用其他经批准的方法进行精制多糖制备。

2.2.5.4　精制多糖检定

按3.1项进行。

2.2.5.5　保存与保存时间

保存于-20℃或以下，保存时间应符合批准的要求。

2.2.6　多糖衍生物制备与检定

2.2.6.1　多糖衍生物制备

将精制多糖溶解后，按适宜比例加入溴化氰进行活化，然后向反应液中加入适宜浓度的己二酰肼，反应适宜时间。再将反应液超滤或透析，得多糖衍生物溶液；可冻干得多糖衍生物固体。

2.2.6.2　多糖衍生物检定

取多糖衍生物溶液，按3.2项进行。

2.2.6.3　保存及有效期

于适宜温度保存，保存时间应符合批准的要求。

2.2.7　载体蛋白

载体蛋白为破伤风类毒素。破伤风类毒素原液制造和检定应符合“吸附破伤风疫苗”2.1～2.2项规定。

可采用柱色谱法或其他经批准的方法对破伤风类毒素原液进一步纯化，并配制至适宜浓度。

2.2.8　多糖蛋白结合物原液制备与检定

2.2.8.1　多糖蛋白结合物原液制备

采用批准的方法制备多糖蛋白结合物，将多糖衍生物和破伤风类毒素以适宜浓度混合，加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDAC）进行反应，经色谱或其他经批准的方法纯化并除菌过滤制成多糖蛋白结合物原液。

2.2.8.2　多糖蛋白结合物原液检定

按3.3项进行。

2.2.8.3　保存与保存时间

于适宜温度保存，保存时间应符合批准的要求。

2.3　半成品

2.3.1　配制

用适宜稀释剂稀释多糖蛋白结合物原液。每1ml含多糖不少于20μg，可加适量乳糖或其他经批准的稳定剂。

2.3.2　半成品检定

按3.4项进行。

2.4　成品

2.4.1　分批

应符合生物制品分包装及贮运管理（通则0239）规定。

2.4.2　分装及冻干

应符合生物制品分包装及贮运管理（通则0239）规定。

2.4.3　规格

按标示量复溶后每瓶0.5ml，含多糖10μg。每1次人用剂量0.5ml。

2.4.4　包装

应符合生物制品分包装及贮运管理（通则0239）规定。

3　检定

3.1　精制多糖检定

3.1.1　鉴别试验

采用免疫双扩散法（通则3403），应与b型流感嗜血杆菌免疫血清形成明显沉淀线。

3.1.2　检查

3.1.2.1　固体总量

依法测定（通则3101）。

3.1.2.2　核糖含量

以D-核糖为对照，应为320～410mg/g（通则3421）。

3.1.2.3　磷含量

应为68～90mg/g（通则3103）。或采用其他经批准的方法。

3.1.2.4　蛋白质含量

应小于10mg/g（通则0731第二法方法1）。或采用其他经批准的方法。

3.1.2.5　核酸含量

应小于10mg/g，核酸在波长260nm处的吸收系数（）为200（通则0401）。

3.1.2.6　多糖分子大小分布测定

采用适宜浓度的氯化钠溶液为流动相，琼脂糖CL-4B凝胶柱（1.6cm×100cm）测定，K_D小于0.5的多糖回收率应大于50%（通则3419）。或采用其他经批准的方法，应符合批准的要求。

3.1.2.7　苯酚残留量

依法（通则3113）或采用其他经批准的方法检查，应不高于6.0mg/g。

3.1.2.8　细菌内毒素检查

依法检查（通则1143），应小于10EU/μg。

3.2　多糖衍生物检定

3.2.1　己二酰肼含量

应为16～45μg/mg，或符合批准的要求（通则3118）。

3.2.2　氰化物残留量

应不大于10ng/mg（通则0806第三法）。或采用其他经批准的方法。

3.3　多糖蛋白结合物原液检定

3.3.1　鉴别试验

采用免疫双扩散法（通则3403），应与b型流感嗜血杆菌免疫血清及破伤风类毒素免疫血清形成明显沉淀线。或采用其他经批准的免疫学方法。

3.3.2　化学检定

3.3.2.1　多糖含量

以D-核糖为对照，按核糖含量计算结合物中多糖含量，应不低于28μg/ml（通则3421）。或采用其他经批准的方法。

3.3.2.2　蛋白质含量

应不低于48μg/ml（通则0731第二法方法1）。

3.3.2.3　多糖与蛋白质的比值

按3.3.2.1与3.3.2.2测定结果计算，应为0.30～0.59。

3.3.2.4　高分子结合物含量或游离多糖含量

高分子结合物应为80%～100%（通则3119）。或采用其他经批准的方法，游离多糖含量应不大于20%。

3.3.2.5　游离载体蛋白含量

采用经批准的方法测定，游离载体蛋白含量应符合批准的要求。

3.3.2.6　多糖蛋白结合物分子大小分布测定

采用适宜浓度的氯化钠溶液为流动相，琼脂糖CL-4B凝胶柱（1.6cm×100cm）测定，K_D值应不高于0.20，K_D值小于0.20的洗脱液回收率应大于60%（通则3419第二法）。或采用其他经批准的方法，应符合批准的要求。

3.3.2.7　碳二亚胺残留量

应小于10μmol/L（通则3206）。

3.3.3　无菌检查

依法检查（通则1101），应符合规定。

3.3.4　细菌内毒素

依法检查（通则1143），应小于5EU/μg。

3.4　半成品检定

无菌检查

依法检查（通则1101），应符合规定。

3.5　成品检定

除水分、装量差异、高分子结合物或游离多糖含量、多糖结合物分子大小分布、多糖含量外，按标示量加入所附稀释剂，复溶后进行其余各项检定。

3.5.1　鉴别试验

采用免疫双扩散法（通则3403），应与b型流感嗜血杆菌免疫血清及破伤风类毒素免疫血清形成明显沉淀线。或采用其他经批准的免疫学方法。

3.5.2　物理检查

3.5.2.1　外观

应为白色疏松体，按标示量加入所附稀释剂应迅速溶解，复溶后应为无色澄明液体，无异物。

3.5.2.2　装量差异

依法检查（通则0102），应符合规定。

3.5.2.3　渗透压摩尔浓度

依法检查（通则0632），应符合批准的要求。

3.5.3　化学检定

3.5.3.1　水分

应不高于3.0%（通则0832）。

3.5.3.2　pH值

依法检查（通则0631），应符合批准的要求。

3.5.3.3　多糖含量

采用适宜方法去除相关辅料，依法检查（通则3421）。以D-核糖为对照，按核糖含量计算结合物中多糖含量，每1次人用剂量含多糖应符合批准的要求。或采用其他经批准的方法。

3.5.3.4　高分子结合物或游离多糖含量

高分子结合物应为80%～100%（通则3119）。或采用其他经批准的方法，游离多糖含量应不大于20%。

3.5.3.5　多糖结合物分子大小分布测定

采用适宜浓度的氯化钠溶液为流动相，琼脂糖CL-4B凝胶柱（1.6cm×100cm）测定，K_D值应不高于0.20，K_D值小于0.20的洗脱液回收率应大于60%（通则3419第二法）。或采用其他经批准的方法，应符合批准的要求。

3.5.4　无菌检查

依法检查（通则1101），应符合规定。

3.5.6　异常毒性检查

依法检查（通则1141），应符合规定。

3.5.7　细菌内毒素检查

依法检查（通则1143），每1次人用剂量应小于25EU。

4　稀释剂

稀释剂为灭菌注射用水、灭菌氯化钠溶液或无菌、无热原PBS，稀释剂的生产应符合批准的要求。

灭菌注射用水应符合本版药典（二部）的相关规定。

灭菌氯化钠溶液或无菌、无热原PBS应符合以下要求。

4.1　外观

应为无色澄清液体。

4.2　可见异物检查

依法检查（通则0904），应符合规定

4.3　pH值

依法检查（通则0631），应符合批准的要求。

4.4　装量

依法检查（通则0102），应不低于标示量。

4.5　无菌检查

依法检查（通则1101），应符合规定。

4.6　细菌内毒素检查

依法检查（通则1143），应不高于0.25EU/ml。

5　保存、运输及有效期

于2～8℃保存和运输。自生产之日起，有效期为24个月或符合批准的要求。

6　使用说明

应符合生物制品分包装及贮运管理（通则0239）规定和批准的内容。