3430 细胞种属鉴别法

细胞种属鉴别是生物制品生产用细胞基质质量控制要求之一，也是保障生物制品生产使用正确细胞基质、防止细胞误用或交叉污染的重要措施。细胞种属鉴别是对细胞基质的物种来源进行鉴定，生物制品生产用细胞基质均应进行种属鉴别，可选择以下一种或两种方法进行。如已知供试品的细胞种属信息且在多重PCR法可检测的种属范围内，可选择多重PCR法进行鉴别并判定是否存在其他种属来源细胞的交叉污染；如供试品为未知样本，可选择DNA条形码法进行检测，根据序列比对结果确定细胞种属。

第一法 多重PCR法

多重PCR法系通过扩增动物细胞线粒体细胞色素b、细胞色素氧化酶Ⅰ（COXⅠ）或细胞色素氧化酶Ⅱ（COXⅡ）基因，鉴别细胞种属来源。本法适用于猪、人、猫、中国仓鼠、恒河猴、非洲绿猴、大鼠、犬、小鼠和牛的细胞种属鉴别。

试剂　（1）PCR反应预混液（2×）含MgCl₂、扩增酶、dNTPs等，按照试剂使用说明书配制，如需要可适当增加扩增酶用量。也可使用符合条件的其他配方预混液。

（2）推荐的检测引物

猪

正向引物：5′-CGGTGAATAGGAAGATGAAGCCCAG-3′

反向引物：5′-TCTACTATCCCTGCCAGTTCTAGCAGCTG-3′

人

正向引物：5′-TAGACATCGTACTACACGACACGTACTACG-3′

反向引物：5′-CACTCCAGGTTTATGGAGGGTTCTTCT-3′

猫

正向引物：5′-TATTGCCATTCCTACCGGGGTG-3′

反向引物：5′-GTGCTGAGGGAAGAACGTTATATTGACTC-3′

中国仓鼠

正向引物：5′-ACTAACCCGCTTCTTCGCATTC-3′

反向引物：5′-GCGTAGGCGAACAGGAAGTATC-3′

恒河猴

正向引物：5′-CCCACCCAGTTCAACTAAGCCTAC-3′

反向引物：5′-GATGGTGAAGGATGGGTCATTGACTTC-3′

非洲绿猴

正向引物：5′-CCTGCTACTTATGGGATCAACCATAATCGA-3′

反向引物：5′-TAGGATTGCTGTGATTAGGACAGATCAGAC-3′

大鼠

正向引物：5′-CTTCGGCCACCCAGAAGTGTAC-3′

反向引物：5′-AGGCTCGGGTGTCTACATCTAGG-3′

犬

正向引物：5′-GAACTAGGTCAGCCCGGTACTTTACT-3′

反向引物：5′-TTCGGGGGAATGCCATGTCC-3′

小鼠

正向引物：5′-ACAGCCGTACTGCTCCTATTATCACTAC-3′

反向引物：5′-CCCAAAGAATCAGAACAGATGCTGGT-3′

牛

正向引物：5′-GCTATTCCAACCGGGGTAAAAGTCTTC-3′

反向引物：5′-GCCTAGGGCTCACATTATAGCAGG-3′

（3）引物贮备液　取各种属引物适量，加用焦碳酸二乙酯处理过的水（DEPC水）分别配制成100μmol/L的溶液，置-20℃及以下保存备用。

（4）混合引物工作液　分别取各引物贮备液适量，用DEPC水稀释并制成，各引物终浓度分别为：猪400nmol/L、人100nmol/L、猫100nmol/L、中国仓鼠600nmol/L、恒河猴70nmol/L，非洲绿猴400nmol/L，大鼠80nmol/L，犬180nmol/L，小鼠70nmol/L，牛200nmol/L。充分混合，分装，置-20℃及以下保存备用。

阳性质控品贮备液的制备　混合种属阳性质控品包含10个种属的细胞基因组DNA，其中人、猫、非洲绿猴、大鼠、犬、小鼠和牛的细胞基因组DNA终浓度为1ng/μl，猪细胞基因组DNA终浓度为4ng/μl，中国仓鼠细胞基因组DNA终浓度为6ng/μl，恒河猴细胞基因组DNA终浓度为0.5ng/μl，充分混合，分装，置-20℃及以下保存备用。亦可使用单一或部分种属阳性质控品，细胞基因组DNA的浓度按上述相应种属终浓度配制。

供试品的制备　可收集活细胞1×10⁵～1×10⁶个，以每分钟250g离心5分钟，弃去上清，取细胞沉淀。若不立即检测，可置-70℃及以下保存不超过6个月。

检查法　（1）核酸提取　取供试品细胞沉淀样品管，用核酸提取试剂盒或细胞裂解液提取DNA，作为供试品基因组DNA提取液，置-20℃及以下保存备用。取空白管同法操作，作为阴性质控品（NCS）。

（2）PCR反应液制备

阳性质控品工作液：取DEPC水18μl，置1.5ml离心管中，加阳性质控品贮备液2μl，混匀。

PCR反应液：

PCR反应液所需成分与体积如下表（不同的反应体系可适当调整）。

①反应孔数=无模板对照1个+阴性质控1个+供试品数+阳性质控1个。

②PCR反应液体积（预估1孔损失量）=17μl×（反应孔数+1）

③取各试剂置冰上或2～8℃融化后配制多重PCR反应液。混匀，按照每管17μl分装至8联管中备用。

④按下表在相应区间加入样品8μl，反应总体积为25μl。

（3）PCR扩增　在PCR仪器上设置反应程序，设定如下参数：

阶段1：95℃，5分钟；

阶段2：95℃，30秒，62℃，3分钟，68℃，30秒，重复25～30个循环（循环数可根据仪器及电泳结果调整）；

阶段3：68℃，30分钟。

（4）琼脂糖凝胶电泳　取PCR产物及DNA分子量标准品（50bp DNA ladder或DL500 Marker）5～8μl，上样于2%～2.5%琼脂糖凝胶泳道（胶长至少60mm），照电泳法（通则0541第三法），80～110V恒压电泳，溴酚蓝条带接近凝胶边缘处时停止电泳。采用凝胶成像仪，以50bp DNA ladder（或DL500 Marker）为标记，分析电泳结果。

试验有效性判定　（1）无模板对照和阴性质控应无条带；

（2）阳性质控各条带应清晰可见。混合种属阳性质控应有10条扩增条带，且条带大小理论值分别为：猪464bp、人394bp、猫355bp、中国仓鼠315bp、恒河猴287bp、非洲绿猴256bp、大鼠200bp、犬172bp、小鼠147bp、牛93bp。单一或部分种属阳性质控扩增条带应与上述相应种属条带大小一致。

结果判定　通过比对供试品和阳性质控的扩增条带，判定供试品的种属。若供试品有两条及以上扩增条带，需与阳性质控的扩增条带进行比对，判断污染的细胞种属。

注意事项　（1）为避免污染，PCR反应液制备需对实验环境进行阳性区间和阴性区间的划分。在阳性区间制备阳性质控品工作液，在阴性区间制备PCR反应液。

（2）为便于结果判定，电泳时，建议将供试品与阳性质控选择在非边缘的邻近孔上样。

（3）本法也可采用核酸分析仪进行扩增产物分析。

（4）本法也可使用经验证后的商品化试剂盒进行核酸扩增，可根据试剂盒说明书操作。不同反应体系可适当调整引物浓度、样品浓度以及反应体系等参数。

第二法 DNA条形码法

DNA条形码法系采用PCR法扩增动物细胞线粒体细胞色素C氧化酶亚单位I基因，通过序列比对分析鉴别细胞种属来源。本法适用于人、猴、小鼠、仓鼠、大鼠、犬、猪、兔、水貂、豚鼠、地鼠、土拨鼠、猫、牛、鸡、鸭及昆虫17个种属来源的细胞种属鉴别。

试剂　（1）核酸提取试剂　核酸提取可使用细胞基因组提取试剂盒或其他核酸提取试剂，实验选用的试剂需能够提取到满足后续实验要求的模板DNA。

（2）PCR扩增试剂　应使用合适的扩增酶或PCR反应预混液。实验选用的PCR扩增试剂应能够满足试验有效性要求。

（3）引物序列　见下表。

续表

注：①下划线部分序列为M13通用引物序列。

②扩增引物选择：本法所列引物已验证可用于鉴别17个种属来源的细胞，包括人、猴、小鼠、仓鼠、大鼠、犬、猪、兔、水貂、豚鼠、地鼠、土拨鼠、猫、牛、鸡、鸭和昆虫来源的细胞。其他种属来源的细胞需验证后使用。可根据供试品可能的物种来源选择引物进行检测，如人、猴、小鼠、仓鼠、大鼠、犬、猪、兔及水貂来源细胞可选择V引物，豚鼠、地鼠、土拨鼠和昆虫来源细胞可选择L引物，猫、牛、鸡和鸭种属来源细胞选择V引物或L引物均可。

供试品的制备　可收集活细胞1×10⁵～1×10⁶个，以每分钟250g离心5分钟，弃去上清，取细胞沉淀。若不立即检测，可置-70℃及以下保存不超过6个月。

检查法　（1）核酸提取　取供试品细胞沉淀，用核酸提取试剂进行核酸提取。模板DNA纯度应满足A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.8～2.0之间。

（2）PCR反应液制备　按照核酸扩增试剂说明书配制PCR反应液，PCR反应体系以50μl为参照，其中引物终浓度为0.2μmol/L，DNA模板加样量根据扩增试剂说明书要求范围添加，实验包括阴性对照（模板为水）、阳性对照（模板为种属来源正确的细胞提取的核酸）和待检细胞提取的核酸样本。

（3）PCR扩增　在PCR仪器上设置反应程序，设定如下参数：

阶段1：94℃，2分钟，94℃，30秒，50℃，40秒，72℃，1分钟，重复5个循环；

阶段2：94℃，30秒，54℃，40秒，72℃，1分钟，重复35个循环；

阶段3：72℃，10分钟。

（4）琼脂糖凝胶电泳　取PCR产物5μl，上样于含核酸凝胶染色剂的1.5%琼脂糖凝胶泳道，照电泳法（通则0541第三法），100～150V恒压电泳。不含上样缓冲液的供试品需与适量上样缓冲液混合后上样。在凝胶成像仪上检视，DNA分子量标准品（100bp DNA ladder或其他合适的DNA ladder）与反应产物同时电泳作为标记，PCR产物应在约750bp的位置出现一条目的条带。

（5）序列测定　回收750bp位置的扩增产物，使用M13通用引物对回收产物进行双向测序，获得目标核酸序列。测序模板制备和测序过程中应防止外源DNA污染，避免外部因素对测序模板的破坏和降解。测序完成后，需对核酸测序结果进行序列质量核查，并对合格的测序结果进行拼接。

（6）利用数据库进行比对及分析，根据序列比对分析结果确定细胞种属来源。

试验有效性判定　（1）阴性对照应无扩增条带。

（2）阳性对照应能在750bp左右检测到一条目的条带，且序列分析结果应与相应阳性对照细胞的种属一致。

结果判定　供试品在750bp左右有一条目的条带，且测序结果未出现套峰，根据序列比对结果，选择与数据库中同源性最高且满足同源性95%以上的物种判定为该细胞的种属。如测序结果出现套峰（排除测序异常），说明细胞存在不同种属细胞的交叉污染，需要结合其他方法对污染细胞的种属进行进一步鉴定。

注意事项　（1）试验操作应符合聚合酶链式反应法（通则1001）和DNA测序技术指导原则（指导原则9108）的相关要求。

（2）本法不适用于鉴别发生交叉污染的细胞种属。

（3）不同反应体系可适当调整引物浓度、反应体系等参数。