3203　聚山梨酯80测定法

第一法 比色法

本法系依据聚山梨酯80中的聚乙氧基（Polyethoxylated）和铵钴硫氰酸盐反应形成蓝色复合物，可溶于二氯甲烷，用比色法测定聚山梨酯80含量。

测定法　量取供试品1.0ml于离心管中，加乙醇-氯化钠饱和溶液5ml，摇匀，以每分钟3000转离心10分钟，取上清液，再用乙醇-氯化钠饱和溶液1.0ml小心冲洗管壁，洗液与上清液合并，以每分钟3000转离心10分钟，上清液置55℃水浴中，用空气吹扫法将其浓缩至0.1～0.5ml，加1ml水溶解。准确加入二氯甲烷2.0ml、硫氰钴铵溶液（称取硝酸钴6.0g、硫氰酸铵40.0g，加水溶解并稀释至200ml）3.0ml，加塞，混匀，室温放置1.5小时，每15分钟振荡1次，测定前静置半小时，弃上层液，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在波长620nm处测定下层二氯甲烷液的吸光度。用二氯甲烷作空白对照。

精密量取聚山梨酯80对照品溶液（取聚山梨酯80约100mg，精密称定，加水溶解后置100ml量瓶中，加水稀释至刻度）0、10μl、25μl、50μl、75μl、100μl，加入预先加入1ml水的离心管中混匀，准确加入二氯甲烷2.0ml、硫氰钴铵溶液3.0ml，加塞，混匀，自本法前述“室温放置1.5小时”起，同法操作。

以上述聚山梨酯80对照品溶液系列浓度（μg/ml）对其相应的吸光度作直线回归，相关系数应不低于0.98，将供试品溶液吸光度代入直线回归方程，求得供试品溶液中聚山梨酯80含量（μg/ml）。

第二法 荧光胶束法

本法系基于高效液相色谱系统和荧光染色法建立，用于测定聚山梨酯80的含量。其原理是聚山梨酯80在达到临界浓度后可形成具有疏水内核的胶束，（流动相中的）荧光染料苯基萘胺在水溶液中荧光信号较低，在疏水环境（如胶束核心）中荧光信号激增，其荧光强度在一定范围内与聚山梨酯80浓度呈线性关系，通过测定荧光强度值（峰面积）可计算供试品溶液中聚山梨酯80的浓度。

试液配制

苯基萘胺溶液　取N-苯基-1-萘胺0.11g，置50ml量瓶中，加乙腈适量使溶解并定容至刻度，摇匀。

聚氧乙烯（35）十二烷基醚溶液　取30%聚氧乙烯（35）十二烷基醚溶液1.0ml，置10ml量瓶，用水稀释至刻度，摇匀。

三羟甲基氨基甲烷混合溶液　取氯化钠8.75g和三羟甲基氨基甲烷6.05g，加水800ml，搅拌使溶解，用盐酸调节pH值至8.0，加乙腈50ml，加水至1L，摇匀，滤过，加苯基萘胺溶液和聚氧乙烯（35）十二烷基醚溶液各0.5ml，摇匀。

供试品溶液　取供试品，必要时定量稀释至适宜浓度。

对照品贮备液　精密称取聚山梨酯80对照品约0.25g，用水溶解并定容至100ml，摇匀。

对照品溶液　临用新制。精密量取对照品贮备液适量，用水分别定量稀释制成每1ml中分别约含聚山梨酯80 0.05mg、0.10mg、0.20mg、0.40mg和0.50mg的溶液，摇匀。

系统适用性溶液　每1ml约含聚山梨酯80 0.20mg的对照品溶液。

试验条件　采用反应线圈（如Knitted Reaction Coil, 5m×0.50mm ID；或REACTION COIL-750μl或其他适宜反应线圈）；流动相为三羟甲基氨基甲烷混合溶液，流速1.5ml/min；检测波长激发光350nm、发射光420nm，增益值5；采集时间2.5分钟，压力上限100bar，柱温35℃，样品盘温度2～8℃，进样量10μl。

系统适用性要求　所有系统适用性溶液图谱中聚山梨酯80峰面积的相对标准偏差应不大于10.0%，系统适用性溶液中聚山梨酯80的回收率（聚山梨酯80浓度的测定值与理论值的比值）应在85%～115%之间；线性回归方程的相关系数不小于0.99。

测定法　取系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品溶液浓度与相应峰面积计算线性回归方程，再根据供试品溶液图谱中聚山梨酯80的峰面积计算供试品溶液中聚山梨酯80的浓度。

注意事项　（1）流动相需临用新制，避光保存；对照品溶液浓度和试验条件可视实际情况调整。

（2）如供试品中的蛋白等组分在聚山梨酯80出峰位置存在明显干扰，可对供试品进行稀释或前处理（参照第一法）后再进行分析。

（3）供试品进样6针后，需进样系统适用性溶液以确定系统适用性。