3408　抗生素残留量检查法（培养法）

本法系依据在琼脂培养基内抗生素对微生物的抑制作用，比较对照品与供试品对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，检查供试品中氨苄西林或四环素残留量。

磷酸盐缓冲液的制备　称取磷酸二氢钾8.0g、磷酸氢二钾2.0g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃灭菌30分钟（pH 6.0）。

抗生素Ⅱ号培养基的制备　称取胨6g、牛肉提取粉1.5g和酵母浸出粉6g，加适量水溶解后，加入琼脂13～14g，加热使之溶胀，滤过，取上清液，加入葡萄糖1g，振摇使溶解，加水至1000ml，调pH值，使灭菌后pH值为6.5～6.6；分装于玻璃管或锥形瓶中，经115℃灭菌30分钟，4℃保存。

供试品溶液的制备　除另有规定外，液体供试品直接检测，冻干供试品按照标示量复溶后检测。

对照品溶液的制备　取氨苄西林对照品适量，用0.01mol/L盐酸溶解并制成每1ml中含氨苄西林10.0mg的溶液，精密量取适量，用磷酸盐缓冲液稀释成每1ml中含1.0μg的溶液。

取四环素对照品适量，用0.9%氯化钠溶液溶解并稀释成每1ml中含0.125μg的溶液（临用新制）。

菌悬液的制备　（1）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液　用于检测氨苄西林。取金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9%无菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。

（2）藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液　用于检测四环素。取藤黄微球菌[CMCC（B）28001]营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，置26～27℃培养24小时。临用时，用0.9%无菌氯化钠溶液将菌苔洗下并调节菌悬液浓度，使10倍稀释后600nm吸光度值约为0.3，备用。

检查法　取直径8cm或10cm的培养皿，注入融化的抗生素Ⅱ号培养基15～20ml，使在碟底均匀摊布，置水平台上使凝固，作为底层。取抗生素Ⅱ号培养基10～15ml置于1支50℃水浴预热的试管中，加入0.5%～1.5%（ml/ml）的菌悬液100～300μl混匀，取适量注入已铺制底层的培养皿中，置水平台上，冷却后，在每个培养皿上等距离均匀放置钢管（内径6～8mm、壁厚1～2mm、管高10～15mm的不锈钢管，表面应光滑平整），于钢管中依次滴加供试品溶液、阴性对照溶液（磷酸盐缓冲液）及对照品溶液。培养皿置37℃培养18～22小时。

结果判定　对照品溶液应有抑菌圈，阴性对照溶液应无抑菌圈。供试品溶液抑菌圈的直径小于对照品溶液抑菌圈的直径时判为阴性；否则判为阳性。

【附注】　本试验应在无菌条件下进行，使用的玻璃仪器、钢管等应无菌。供试品如存在干扰成分，则不宜采用此法，应建立其他适宜方法检测。