3102　唾液酸测定法

第一法 间苯二酚显色法

本法系用酸水解方法将结合状态的唾液酸变成游离状态，游离状态的唾液酸与间苯二酚反应生成有色化合物，再用有机酸萃取后，测定唾液酸含量。

唾液酸对照品溶液（200μg/ml）的制备　精密称取唾液酸对照品10.52mg（1μg唾液酸相当于3.24nmol），置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀，即为唾液酸贮备液（1mg/ml），按一次使用量分装，-70℃贮存，有效期1年。仅可冻融1次。4℃保存，使用期为2周。精密量取唾液酸贮备液1ml，置5ml量瓶中，加水至刻度，即为每1ml含200μg的唾液酸对照品溶液，用前配制。

用于脑膜炎球菌多糖疫苗唾液酸含量测定时，同法制备浓度为400μg/ml的唾液酸对照品溶液贮备液（精密称取唾液酸40mg，置100ml量瓶中，用纯化水溶解并定容至刻度，混匀，即得）。精密量取唾液酸贮备液2.0ml，置10ml量瓶中，加水至刻度，即为每1ml含80μg的唾液酸对照品溶液，用前配制。

测定法　取供试品适量，加水稀释至蛋白质浓度为每1ml含0.2～0.4mg，作为供试品溶液。按下表取唾液酸对照品溶液、水及供试品溶液于10ml玻璃试管中，混匀，每管再加入间苯二酚-盐酸溶液（分别量取2%间苯二酚溶液2.5ml、0.1mol/L硫酸铜溶液62.5μl、25%盐酸溶液20ml，加水稀释至25ml，混匀。试验前4小时内配制）1ml，加盖，沸水煮沸30分钟（水浴面高于液面约2cm），取出置冰浴中3分钟（同时振摇）后，每管加乙酸丁酯-丁醇溶液（取4体积乙酸丁酯与1体积丁醇混匀，室温下保存，12小时内使用）2ml，充分混匀，室温放置10分钟，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在波长580nm处测定吸光度。

脑膜炎球菌疫苗唾液酸含量测定：取含唾液酸约40μg/ml的供试品溶液和纯水对照各2ml；另分别取唾液酸对照品（80μg/ml）0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.6ml于各管中，补水至2.0ml为标准曲线各点。各管加2ml显色剂（0.1mol/L硫酸铜溶液0.5ml、4%间苯二酚溶液5ml、浓盐酸80ml，补水至100ml混匀。临用现配）摇匀，沸水浴15分钟后冰浴5～10分钟，每管加4ml有机相（正丁醇15ml，加乙酸丁酯定容至100ml），充分摇匀后置室温10分钟。以纯水对照为0点，于585nm测定吸光度，并作直线回归。（可按比例缩小供试品及各试剂体积）

以唾液酸对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归（相关系数应不低于0.99），由直线回归方程计算5μg唾液酸的吸光度值，再按下式计算供试品唾液酸含量。

式中　A₁为5μg唾液酸的吸光度；

A₂为供试品的吸光度；

n为供试品稀释倍数；

P为供试品蛋白质含量，μg/μl；

W为1nmol促红素的量，相当于30.6μg。

式中　A为供试品溶液吸光度相对于唾液酸对照品溶液的浓度，μg/ml；

n为供试品的稀释倍数。

第二法 超高效液相色谱法

本法系通过醋酸水解释放糖蛋白的唾液酸，再对释放的唾液酸进行标记，然后用超高效液相色谱（UPLC）对糖蛋白中的唾液酸进行测定。

照高效液相色谱法（通则0512）测定。

试剂　（1）醋酸溶液　取冰醋酸12g，加水至100ml，混匀。

（2）衍生溶液　避光操作。取水1.5ml、冰醋酸172μl和2-巯基乙醇112μl，混匀，加连二亚硫酸钠4.9mg，使溶解；再加4，5-亚甲二氧基-1，2-苯二胺二盐酸盐（DMB）3.5mg，加水200μl使充分溶解并混匀。

对照品溶液　取N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为贮备液（1）；取N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）约10mg，精密称定，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为贮备液（2）；精密量取贮备液（1）和贮备液（2）各4ml，置250ml量瓶中，用醋酸溶液稀释至刻度，作为混合对照品贮备液。

精密量取混合对照品贮备液0.4ml、0.8ml、2ml、4ml、8ml，分别置10ml量瓶中，用醋酸溶液稀释至刻度。精密量取以上溶液各200μl，置80℃孵育2～2.5小时，放冷。分别精密量取5μl，精密加入衍生溶液20μl，涡旋混匀，50℃避光孵育3小时，精密加水475μl终止反应，作为对照品溶液（1）～（5）。

供试品溶液　取供试品适量，置10kD超滤离心管中，不低于13 500转离心10分钟，弃去下层溶液。10kD超滤离心管中加水300μl，每分钟13 500转离心10分钟，弃去下层溶液，重复操作两次。取截留的上层溶液用适宜方法测定蛋白质含量，用醋酸溶液稀释至适宜浓度（含Neu5Ac约为10～20μmol/L），取200μl置80℃孵育2～2.5小时，放冷，精密量取5μl，加精密量取的衍生溶液20μl，涡旋混匀，50℃避光孵育3小时，精密加水475μl终止反应并混匀。

空白溶液　精密量取醋酸溶液200μl，自供试品溶液项下“置80℃孵育2～2.5小时”起，同法制备。

色谱条件　用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（2.1mm×100mm, 1.7μm，或等效的色谱柱），柱温为30℃；以乙腈-甲醇-水（9∶7∶84）为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱，流速为每分钟0.25ml；荧光检测器，激发波长为373nm，发射波长为448nm；样品室温度为2～8℃，进样体积为5μl。

系统适用性要求　空白溶液色谱图中应无干扰峰。

对照品溶液（3）色谱图中Neu5Ac峰和Neu5Gc峰之间的分离度应不小于2.0，重复进样Neu5Ac和Neu5Gc峰面积的相对标准偏差（RSD）均应不大于5%（n=6）；对照品溶液（1）色谱图中Neu5Gc峰的信噪比应不小于10。

以对照品溶液（1）～（5）中Neu5Ac和Neu5Gc浓度分别对其对应的峰面积计算线性回归方程，相关系数（r）均应不小于0.99。

测定法　精密量取空白溶液、对照品溶液（1）～（5）与供试品溶液，依序注入液相色谱仪，顺序为空白溶液（进样1针）、对照品溶液（3）（进样6针）、对照品溶液（1）～（5）、供试品溶液（1）、供试品溶液（2）……对照品溶液（3）（各进样1针），记录色谱图。

以对照品溶液（1）～（5）中Neu5Ac和Neu5Gc的浓度为横坐标，以其对应的峰面积为纵坐标，作线性回归方程。根据测得的供试品溶液峰面积，从线性方程分别计算Neu5Ac和Neu5Gc的浓度，按下式计算供试品中唾液酸（Neu5Ac或Neu5Gc）含量。1mg Neu5Ac相当于3.24μmol, 1mg Neu5Gc相当于3.08μmol。

式中　A为供试品溶液中Neu5Ac或Neu5Gc的浓度，μmol/L；

P为供试品溶液中蛋白质含量，mg/ml；

W为每1μmol蛋白质的量，相当于重量，mg；

n为供试品稀释倍数。

注意事项　（1）荧光检测器的增益可进行调节，以获得合适的信号响应强度。

（2）可采用优级纯试剂制备衍生溶液以避免产生干扰。该溶液可在-20℃条件暗处保存一年。衍生溶液也可采用经验证的商品化试剂盒。

（3）Neu5Ac和Neu5Gc均在0.04～40μmol/L浓度范围内，分别与其相应的峰面积呈良好线性。在线性范围内，可根据供试品中Neu5Ac和Neu5Gc的含量制备适宜浓度的对照品溶液（1）～（5）。

（4）如供试品中唾液酸含量较低，加水超滤换液后也可用4mol/L醋酸溶液进行稀释以保证供试品溶液中醋酸溶液的终浓度为2mol/L。

（5）唾液酸除常见的Neu5Ac和Neu5Gc外，还包括O-乙酰化的唾液酸（Neu5，7Ac₂、Neu5Gc, 9Ac、Neu5，8Ac₂、Neu5，9Ac₂、Neu5，x，xAc₃），详见图1。本法可同时分离检测7种唾液酸结构，详见图2。按面积归一化法，可计算供试品中各唾液酸占总唾液酸（7种唾液酸）的含量。若需要检测去O-乙酰化的Neu5Ac和Neu5Gc总量（包括5位氨基和4、7、8、9位的羟基发生取代），可在唾液酸释放之前进行去O-乙酰化处理（在供试品中加入10%体积的1mol/L氢氧化钠溶液，放置30分钟后，再加入10%体积的1mol/L盐酸溶液终止反应）。

图1　唾液酸结构图

图2　唾液酸混合对照品（包含7种唾液酸结构）液相图谱

1．Neu5Gc　2．Neu5Ac　3．Neu5，7Ac₂　4．Neu5Gc, 9Ac　5．Neu5，8Ac　6．Neu5，9Ac₂　7．溶剂　8．Neu5，x，xAc₃

第三法 高效液相色谱法

本法系通过醋酸水解释放糖蛋白的唾液酸，再对释放的唾液酸进行标记，然后用高效液相色谱（HPLC）对糖蛋白中的唾液酸进行测定。

照高效液相色谱法（通则0512）测定。

试剂、对照品溶液、供试品溶液、空白溶液、系统适用性要求、测定法和注意事项见第二法超高效液相色谱法。

色谱条件　用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（4.6mm×150mm, 3μm，或等效的色谱柱），柱温为30℃；以乙腈-甲醇-水（9∶7∶84）为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱，流速为每分钟0.5ml；荧光检测器，激发波长为373nm，发射波长为448nm；样品室温度为2～8℃，进样体积为25μl。

第四法 离子色谱法

本法系通过醋酸水解释放糖蛋白上的唾液酸，再采用离子交换色谱-脉冲安培检测器（HPAEC-PAD）对糖蛋白中的唾液酸进行测定。

照离子色谱法（通则0513）测定。

试剂　（1）样品缓冲液（20mmol/L醋酸钠溶液）　取无水醋酸钠164mg，加水80ml使溶解，用冰醋酸调节pH值至5.2，用水稀释至100ml，混匀。

（2）醋酸溶液　取冰醋酸12g，加水至100ml，混匀。

对照品溶液　取N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为贮备液（1）；取N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）约10mg，精密称定，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为贮备液（2）；精密量取贮备液（1）和贮备液（2）各4ml，置250ml量瓶中，用水稀释至刻度，作为混合对照品贮备液。

精密量取混合对照品贮备液5μl、10μl、25μl、50μl、100μl，分别置1.5ml离心管中，冷冻离心干燥，精密加入醋酸溶液100μl，置80℃孵育2～2.5小时，放冷，涡旋混匀，冷冻离心干燥，精密加入水300μl复溶，再加入精密量取的样品缓冲液200μl，涡旋混匀，转移至10kD超滤离心管中，在2～8℃条件下，每分钟4000转离心15分钟，取下层溶液，作为对照品溶液（1）～（5）。

供试品溶液　取供试品适量，用醋酸溶液稀释至适宜浓度（含Neu5Ac约为10～20μmol/L），精密量取100μl，置80℃孵育2～2.5小时，放冷，涡旋混匀，冷冻离心干燥，精密加入水300μl复溶，再加入精密量取的样品缓冲液200μl，涡旋混匀，转移至10kD超滤离心管中，在2～8℃条件下，每分钟4000转离心15分钟，取下层溶液。

空白溶液　精密量取醋酸溶液100μl，自供试品溶液项下“置80℃孵育2～2.5小时”起，同法制备。

色谱条件　用糖分析柱（3mm×150mm，或等效的色谱柱），保护柱（3mm×30mm，或等效的色谱柱）；柱温为30℃；以0.1mol/L氢氧化钠溶液为流动相A，以含1mol/L醋酸钠和0.1mol/L氢氧化钠的水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为每分钟0.5ml；样品室温度为2～8℃；进样体积为25μl。

检测器为脉冲安培检测器（PAD），Au工作电极（推荐使用1mm直径）、Ag/AgCl参比电极，四电位检测波形（电位见下表）进行检测。

系统适用性要求　空白溶液色谱图中应无干扰峰。

对照品溶液（3）色谱图中Neu5Ac峰和Neu5Gc峰之间的分离度应不小于2.0，重复进样Neu5Ac和Neu5Gc峰面积的相对标准偏差（RSD）均应不大于5%（n=6）；对照品溶液（1）色谱图中Neu5Gc峰的信噪比应不小于10。

以对照品溶液（1）～（5）中Neu5Ac和Neu5Gc浓度分别与其对应的峰面积计算线性回归方程，相关系数（r）均应不小于0.99。

序列后对照品溶液（3）色谱图中Neu5Ac和Neu5Gc的峰面积，应为序列前对照品溶液（3）重复进样6针平均峰面积的90%～110%。

测定法　精密量取空白溶液、对照品溶液（1）～（5）与供试品溶液，依序注入离子色谱仪，顺序为空白溶液（进样1针）、对照品溶液（3）（进样6针）、对照品溶液（1）～（5）、供试品溶液（1）、供试品溶液（2）……对照品溶液（3）（各进样1针），记录色谱图。

以对照品溶液（1）～（5）中Neu5Ac和Neu5Gc的浓度为横坐标，以其对应的峰面积为纵坐标，作线性回归方程。根据测得的供试品溶液峰面积，从线性方程分别计算Neu5Ac和Neu5Gc的浓度，再按下式计算供试品中唾液酸（Neu5Ac或Neu5Gc）含量。1mg Neu5Ac相当于3.24μmol, 1mg Neu5Gc相当于3.08μmol。

式中　A为供试品溶液中Neu5Ac或Neu5Gc的浓度，μmol/L；

P为供试品溶液中蛋白质含量，mg/ml；

W为每1μmol蛋白质的量，相当于重量，mg；

n为供试品稀释倍数。

注意事项　（1）样品中蛋白质的存在可能会降低PAD的响应，为保证检测结果的准确性，每进样10针供试品溶液后应进样1针对照品溶液（3）。

（2）为减小PAD响应降低的影响，可使用3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖（KDN）作为内标。具体操作为：取0.1mmol/L KDN溶液作为内标溶液，在对照品溶液（1）～（5）与供试品溶液制备的最后稀释步骤中，分别加内标溶液15μl。以加内标的直线回归方程分别计算供试品溶液中Neu5Ac和Neu5Gc的含量。

（3）Neu5Ac和Neu5Gc均在0.01～10μmol/L浓度范围内，分别与其相应的峰面积呈良好线性。在线性范围内，可根据供试品中Neu5Ac和Neu5Gc的含量制备适宜浓度的对照品溶液（1）～（5）。

（4）不同品牌检测器可能存在差异，可对检测器参数（电位电压等）进行适当调整，以获得合适的信号响应强度。

（5）离子色谱仪品牌不同，色谱柱的品牌/批号不同，对照品溶液的色谱图与参考图谱（图3）在峰型上可能略有差异。可根据色谱柱说明书对色谱条件进行适当调整。

图3　对照品溶液离子色谱图谱

1．Neu5Ac　2．Neu5Gc