3528　人表皮生长因子生物学活性测定法

第一法 细胞增殖法/MTT比色法

本法系依据人表皮生长因子对小鼠胚胎成纤维细胞（BALB/c 3T3细胞）的生长具有刺激作用，BALB/c 3T3细胞的生长状况因人表皮生长因子生物学活性的不同而异，以此检测人表皮生长因子的生物学活性。

试剂　（1）RPMI 1640培养液　取RPMI 1640培养基粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素10⁵IU和链霉素10⁵IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。

（2）维持培养液　量取新生牛血清4ml，加RPMI 1640培养液至1000ml。

（3）完全培养液　量取新生牛血清100ml，加RPMI 1640培养液至1000ml。

（4）磷酸缓冲盐溶液（PBS）　称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。

（5）噻唑蓝（MTT）溶液　称取MTT粉末0.10g，加PBS 20ml使溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。

标准品溶液　取人表皮生长因子标准品，按说明书复溶后，用维持培养液稀释至每1ml含50IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2孔。以上操作在无菌条件下进行。

供试品溶液　将供试品按标示量复溶后，用维持培养液稀释成每1ml约含50IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2孔。以上操作在无菌条件下进行。

测定法 BALB/c 3T3细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×10⁵～5.0×10⁵个细胞，传代后24～36小时用于生物学活性测定。弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1ml含5.0×10⁴～8.0×10⁴个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养。24小时后换成维持培养液，于37℃、5%二氧化碳条件下培养24小时。制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养64～72小时。每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入二甲基亚砜100μl，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。

试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果：

式中　P_r为标准品生物学活性，IU/ml；

D_s为供试品预稀释倍数；

D_r为标准品预稀释倍数；

E_s为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；

E_r为标准品半效量的稀释倍数。

注：显色方法也可以采用经等效验证的其他显色方法。

第二法 报告基因法

本法采用基因修饰的报告基因细胞作为人表皮生长因子生物学活性测定用细胞。当人表皮生长因子与报告基因细胞相互作用后产生荧光素酶，加入底物后可产生化学发光，并且产生的光强度与人表皮生长因子的浓度呈正相关。通过测定发光强度，以此测定人表皮生长因子生物学活性。

试剂　（1）完全培养液　DMEM培养液，10%的胎牛血清，100μg/ml潮霉素。2～8℃保存。

（2）工作培养液　DMEM培养液，10%的胎牛血清。2～8℃保存。

（3）磷酸缓冲盐溶液（PBS）　取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，高压灭菌。

（4）荧光素酶报告基因检测试剂盒。

报告基因细胞 HEK293-SREA2（系为表皮生长因子刺激核心反应元件和荧光素酶报告基因稳定转染入人胚肾293细胞）或其他适宜的报告基因细胞。报告基因细胞的构建及细胞库管理和质控应参照基于基因修饰细胞系的生物检定法指导原则（指导原则9404）要求执行。

标准品溶液　将人表皮生长因子标准品按说明书复溶后，用工作培养液将其稀释至约4IU/ml或适宜浓度。在白色96孔细胞培养板中做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔50μl。

供试品溶液　将供试品按标示量复溶后，用工作培养液将其稀释成约4IU/ml或适宜浓度。在白色96孔细胞培养板中做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔50μl。

测定法　收集在完全培养液中培养的HEK293-SREA2细胞，用工作培养液配制成每1ml约含4.0×10⁵个细胞的细胞悬液。将细胞悬液加入之前制备好的标准品溶液和供试品溶液，每孔50μl，置37℃、5%二氧化碳条件下培养18小时。按荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书加入荧光素酶底物，用化学发光酶标仪测定发光强度，记录测定结果。

结果计算　试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算供试品生物学活性：

式中　P_r为标准品生物学活性，IU/ml；

D_s为供试品预稀释倍数；

D_r为标准品预稀释倍数；

E_s为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；

E_r为标准品半效量的稀释倍数。

注：本试验相关参数是根据报告基因细胞HEK293-SREA2确定，如果采用其他适宜的报告基因细胞株，还需进一步确认试验参数。