0403 近红外光谱法

1 概述

近红外光谱法是在780～2500nm（12800～4000cm^-1）波长范围采集物质的吸收光谱，用于定性分析和定量分析的方法。近红外光谱主要由C—H、N—H、O—H和S—H等基团的中红外（4000～400cm^-1）基频振动的倍频和合频组成，包含复合的化学和物理信息，由于其吸收强度远低于物质中红外光谱的基频振动，吸收峰重叠严重，通常需利用化学计量学等数据处理方法提取相关信息；但当定性方法达到专属性标准时，也可直接与对照品的光谱（包括预处理光谱）比较进行化学鉴别或固态表征。由于在近红外范围内的吸收率低，近红外光可穿透材料（如玻璃、泡罩）数毫米，实现无损测量。除标准取样程序和实验室检测外，还可直接原位测量。

近红外光谱法具有快速、准确、对样品无破坏等特点，在药物分析中具有广泛的适用性。其中，化学分析方面包括原辅料、制剂中组分、生产中间体和包装材料的鉴别和确认，包括批次间光谱比较和供应商变更评估；以及药物中药物活性成分和其他化学值的定量测定，如羟值、水含量，羟基化程度和溶剂含量等。物理分析方面包括结晶形式和结晶度、多态性、溶剂化物、粒度、崩解、硬度、薄膜性能等的分析。过程分析方面包括对合成、结晶、混合、干燥、制粒和涂布等单元操作进行监测；以及控制和终点检测等。

近红外光谱的波长（λ）通常以纳米（nm）表示，波数（υ）通常用厘米倒数（cm^-1）表示。二者的转换关系如下：

2 测量模式

近红外光谱分析中常采用透射、反射和透反射三种测量模式。

2.1 透射模式

一般适用于液体和固体。测量时样品置于光源与检测器之间的光路上，这种测量方式与许多传统光谱仪类似。

采用透射模式时，近红外光谱图的x轴为波长或波数，y轴为透光率（T）或吸光度（A）。透光率（T）是指当近红外光通过样品时，在给定波长处近红外光强度下降的量度，等于透射光强度（I）与入射光强度（I₀）之比。

测量时，固体样品可采用合适的附件固定；液体样品可放置在无近红外吸收的材质制成的样品池中，光程通常为0.5～10mm，或者放置在光纤探头可浸入的装置中。

2.2 反射模式

在近红外光谱法中，最常用的反射模式为漫反射模式，可用于分析固体、半固体和混悬液体样品。近红外光可穿透样品内部，穿透的距离与样品的化学成分和物理性质有关。进入样品的近红外光有一部分会被样品中待测物的倍频和合频的振动吸收，未被吸收的部分从样品中反射出来进入检测器。

采用反射模式时，仪器测得反射率（R），即样品的反射光强度（I）与参比物的反射光强度（I_r）的比值。此时，近红外光谱图的x轴为波长或波数，y轴为lg（1/R）。

采用这种模式，样品可直接检测，或放在合适的装置（例如样品支架）中检测，或直接用光纤探头检测。应用于过程监测时，可以通过抛光窗口界面（如蓝宝石）或使用在线光纤探头对样品进行检测。必须注意确保样品间的测量条件尽可能具有重现性。先扫描参比物得到基线，然后测量被分析物得到反射率。常见的参比物有陶瓷、热塑性树脂和黄金等。

2.3 透反射模式

一般适用于液体、混悬液和透明塑料材料。透反射模式为透射与反射模式的结合，将由金属或无近红外吸收的惰性物质（例如，干燥的二氧化钛）制成的反射镜置于样品后侧，光源与检测器在样品同侧，近红外光穿过样品后经反射镜返回，光程增加为两倍，从而有效提高了仪器的检测灵敏度。

采用透反射模式时，近红外光谱图的x轴为波长或波数，y轴为透反射率（T^*）或吸光度（A^*）。透反射率（T^*）是样品的透反射光强度（I）与参比物透反射光强度（I_T）的比值。

3 仪器及性能确证

3.1 仪器装置

近红外光谱仪由光源、单色器（或干涉仪）、采样附件、检测器、数据处理系统组成。其中，光源常采用高强度的石英或钨灯光源，但钨灯比较稳定；单色器有声光可调型、光栅型和棱镜型等；常用的采样附件包括固体样品架、光纤探头、液体透射池、积分球等；硅、硫化铅、砷化铟、铟镓砷和氘代硫酸三甘肽检测器为常用的检测器。需根据供试品的类型选择合适的检测器和采样附件。

3.2 仪器性能确证

为确保仪器能达到预期的应用目的，应采用标准物质对仪器的性能进行确证。例如，根据应用需求制订SOP定期进行确证，并应在使用中通过自检确保仪器的适用性。近红外光谱仪的确证参数可包括波长范围、波长准确度、吸光度线性与精密度、吸光度噪声等。近红外光谱仪的自检通常通过比较实测光谱与校验时储存于仪器中的标准光谱的差异来实现。自检时除针对上述校验参数设计适当的指标外，还应考虑分析过程中波长的漂移和灵敏度的改变。

仪器的性能确证应定期进行，并应在维修光路或更换光学部件，如光源或采样附件后及时进行。仪器性能确证过程应根据仪器类型、测量方式以及所需要确证的参数选择不同的标准物质，并应在光路中不存在滤光片的配置下，选择合适的性能测试方法。具体如下。

3.2.1 波长范围

除滤光片型仪器外，近红外光谱仪在透射测量方式下，可选择二氯甲烷作为标准物质，在其1155nm、1366nm、1417nm、1690nm、1838nm、1894nm、2068nm和2245nm处的窄带吸收峰中选择3个峰值进行校验。也可使用其他合适的标准物质，如65μm厚的聚苯乙烯薄膜。在反射测量方式下，选择合适的反射介质或光纤探头测量滑石粉，应在948nm、1391nm、2077nm和2312nm处测量得到至少3个较为明显的吸收峰。也可以选择仪器正常工作波长范围内存在明显吸收峰的其他标准物质，如聚苯乙烯标准物质，并根据包含工作波长范围内的至少3个吸收峰位置确定仪器测量波长范围。在透反射测量方式下，将1.2g二氧化钛与约4ml二氯甲烷混合，通入样品池或将光纤探头浸入混合样品。在2500nm处，仪器波长分辨率最大标称值应小于10nm时（或者在4000cm^-1处为16cm^-1），测量得到二氯甲烷在1155nm、1366nm、1417nm、1690nm、1838nm、1894nm、2068nm和2245nm处窄带吸收峰，在仪器测量波长范围内选择3个吸收峰位置确定仪器测量波长范围。也可使用其他合适的混合标准物质。

工艺过程在线检测设备如果无法测量可溯源的标准物质，可使用仪器内置参比物，如聚苯乙烯、玻璃纤维或其他溶剂，以及水蒸气作为参比，或者利用仪器配置的测量支路或探头测量可溯源的标准物质。

傅里叶变换近红外光谱仪具有较高的分辨率，可使用水蒸气吸收峰（例如7306.74cm^-1、7299.45cm^-1或7299.81cm^-1处的吸收峰）进行校验，或有证标准物质的窄吸收谱线来校准波长。

3.2.2 波长准确度

除滤光片型仪器外，近红外光谱仪在透射、反射以及透反射测量方式下，均要求波长的标准偏差符合仪器制造商的规格或分析要求。可以根据仪器测量波长范围及实际应用需要，选择合适的外部或内部标准物质，确证光谱测量的波长准确度。一般情况下，要求仪器测量值与标准值对比得到的典型误差范围满足以下要求：

780nm处应在±1.0nm范围（相当于12 800cm^-1处应在±16cm^-1范围）；

1200nm处应在±1.0nm范围（相当于8300cm^-1处应在±8cm^-1范围）；

1600nm处应在±1.0nm范围（相当于6250cm^-1处应在±6cm^-1范围）；

2000nm处应在±1.5nm范围（相当于5000cm^-1处应在±4cm^-1范围）；

2500nm处应在±1.5nm范围（相当于4000cm^-1处应在±2cm^-1范围）。

选择与以上波长中任意一个最接近的标准物质吸收峰，计算重复测量的误差范围。对于光谱分辨率较低的二极管阵列型仪器，一般要求其分辨率优于10nm。由于需要用到峰值搜索算法，算法的准确性对波长准确度确证结果比较重要。实际应用中，在仪器波长范围内，达到±2nm的波长准确度是可以满足要求的，也可参考仪器制造商技术规范的可接受标准。

3.2.3 吸光度线性与精密度

近红外光谱仪在透射、透反射及反射测量方式下，在线仪器在透反射、透射测量方式下，可在仪器可测吸光度范围内测量4个吸光度标准物质，对吸光度线性与精密度进行确证。例如，透射模式下，在仪器可测量最大吸光度值的10%～90%范围内，选择透光率分别为10%、20%、40%和80%的标准物质，其对应的吸光度值分别为1.0、0.7、0.4和0.1。采用线性回归方法评估标准物质的吸光度值与测量得到的吸光度值偏差。首次确证仪器的吸光度线性时，得到线性回归曲线的斜率应在1.00±0.05范围内，截距应在0.00±0.05范围内。后续吸光度线性确证可使用仪器首次测量吸光度值作为参考值，与测量值进行线性回归，得到的斜率与截距可应分别在1.00±0.05与0.00±0.05范围内。

工艺过程在线仪器如果在样品测量过程中无法测量可溯源的标准物质，则使用仪器内置的吸光度参比物。在这种情况下，需要遵照仪器制造商提供的校验与自检方法。

3.2.4 吸光度噪声

近红外光谱仪以及工艺过程在线仪器的透射、透反射及反射测量方式，可以使用具有合适反射率或透射率的标准物质[例如，白色高反射陶瓷板，或者聚四氟乙烯（PTFE）]。根据仪器制造商建议的测量方式与仪器配置，测量100%线（透射率光谱），并根据峰-峰噪声计算吸光度噪声。

工艺过程在线仪器如果无法测量标准物质，可以测量仪器内置参比物进行光度噪声校验与自检。或者在反射及透反射测量模式下，在合适的波长范围内扫描反射率低的通量标准（如反射率为5%或10%的掺碳的聚合物标准品），并根据峰-峰噪声计算吸光度噪声。透射测量方式可以测量具有较高透射率的标准物质（如90%或99%的掺碳聚合物标准物质），并根据峰-峰噪声计算吸光度噪声。

4 定性和定量方法

4.1 定性分析

包括鉴别和表征。利用近红外光谱法进行定性分析可通过与谱库中谱图比对、与对照品光谱比对及建立化学计量学定性模型三种方式进行。其中，谱库中应包括可溯源的代表性样品的光谱以及对应的测量模式（如光纤探头、积分球等）、样品特性（如固体、粒度等）、光谱范围、数据预处理方法等要素。谱库中同一物质可能包含一组不同要素组合的光谱，鉴别时应选择或采用与供试品具有相同要素光谱进行比对，谱库应明确记录谱库检索的方法和原理。在光谱专属性好或特定单一范围应用（如PAT物料鉴别）时，可直接与对照品光谱进行比对。也可以选择合适的化学计量学方法建立定性模型，实现鉴别和表征，如主成分分析、聚类分析、SIMCA等。定性模型的验证包括专属性和稳健性，参见化学计量学指导原则（指导原则9096）。

4.2 限度分析和趋势分析

通过利用近红外光谱的相对比较可以实现限度分析或趋势分析，如待测物吸收度的变化范围、终点指示等。限度分析和趋势分析不要求建立模型，但必须证明光谱范围和预处理方法的适用性。限度分析和趋势分析的专属性是通过进行与风险控制相适应的极限试验，证明方法的相对分辨能力，同时操作范围内基质浓度的变化不得影响测量。

4.3 定量分析

将样品的近红外光谱与其样品性质（如浓度、粒度等）相关联，选择合适的化学计量学算法，建立定量模型。其中，定量模型中应包括适当数量的代表性样品的光谱，并具有已知的属性值（如水分含量）。建模样品的数量取决于样品基质的复杂性和干扰（如温度、粒度等）。建模样品的理化量值范围为模型的定量范围，定量模型只能给出模型定量范围内的预测结果。常用的化学计量学算法包括多元线性回归（MLR）、主成分回归（PCR）和偏最小二乘回归（PLS）等。定量模型的验证包括专属性、准确性、精密度、线性、稳健性等。定量模型的验证、光谱预处理方法、变量选择、模型评估、模型转移等方法参见化学计量学指导原则（指导原则9096）。

5 近红外光谱的影响因素和关键技术要求

近红外光谱测量时一般不需要对样品进行预处理，但测量时可受多种因素的影响。环境温度、样品的光学性质、多晶型、样品的含水量和溶剂残留量、样品粒度、厚度、硬度、光洁度及样品的贮存时间等均对样品的近红外光谱有影响。液体样品对环境温度最敏感，不同晶型的样品通常具有不同的近红外光谱。近红外光谱分析结果的重现性和相关性往往取决于对主要影响因素的控制。

在建立定性或定量模型前，通常需要对谱图进行数学预处理。归一化处理常用于消除或减弱由位置或光程变化所导致的基线平移或强度变化；导数处理可以提高谱图的分辨率，但导数处理的同时扩大了噪声，因此不建议使用高阶导数，并常辅以平滑处理来消除噪声；对固体样品，采用多元散射校正（MSC）或标准正态变量变换（SNV）校正来消除或减弱光散射引入的基线偏移。

模型应在适用范围内使用，待测样品的测量需采用与建模光谱相同的测量和预处理条件。

近红外模型全生命周期管理应遵循化学计量学指导原则（指导原则9096）的一般原则。

6 近红外光谱在PAT中的应用要求

近红外光谱法是过程分析技术（PAT）中实现快速、无损分析的重要技术之一，可应用“离线（off-line）”“近线（at-line）”“线上（on-line）”和“在线（in-line）”测量方式，在干燥、混合、制粒等工艺中监测包括原辅料、中间体和终产品等，常见的应用场景包括组分鉴别、水分测定、药物活性成分（API）分析等。

在PAT中使用近红外光谱法应遵循质量源于设计（QbD）原则，对待测样品的物理化学特性、测量仪器的原理以及化学计量学方法有充分的理解；应确定近红外方法流程中所基于的所有假设是正确的；在使用中，应包括仪器校准、光谱采集、模型开发及全生命周期管理[参见化学计量学指导原则（指导原则9096）]等步骤。

近红外光谱法作为PAT工具应包括近红外光谱方法、近红外模型、近红外方法流程三个要素。

6.1 近红外光谱方法

为利用近红外仪器设备实现对过程中间体或终产品的关键质量属性（如水分含量、API含量等）进行的定量分析和/或对原辅料等进行的定性分析（如鉴别、分级等）。PAT文件应提供近红外检测设备的相关信息，包括但不限于：仪器制造商和型号、光学系统的分光原理、检测器类型、测量方法或模式以及光谱范围；应描述针对待测样品制备、样品表达（包括如何采样、如何测量光谱）、采样装置以及被认为是建立方法所必需的任何其他额外附件或设备控制的细节；应说明并可证明每次样品光谱的预处理记录和光谱扫描次数；应建立光谱库以及光谱数据收集和存储方式。

6.2 近红外模型

为建立的能够表达样品关键质量属性，如水分、粒度和/或组分含量与近红外光谱之间定量关系的数学表达式，或建立的样品类属与近红外光谱之间定性关系的数学表达式。通常需要使用化学计量学软件、统计软件和/或可视化软件显示从近红外模型输出的结果。需要注意的是，软件自动识别存在一定风险，当过程监控中出现异常值时，应首先使用独立验证集排除偶然因素影响，对超出其定义范围的样品（如超出模型预测范围的值或成分不正确的组分等）参照化学计量学指导原则（指导原则9096）“异常样本”处理。PAT文件应提供近红外方法模型的详细信息，包括所用的商业软件产品信息、化学计量学算法（如PLSR）、选择的变量、预处理方法及相关的参数等；应包括表征模型性能的评价指标及可接受标准，合理的可接受标准可以保证近红外方法在PAT应用生命周期内适用。对于定量方法，通常应说明相关的光谱质量测试标准、模型参数（如PLSR的潜变量数）、校准标准误差（SEC）和预测标准误差（SEP）等。

6.3 近红外方法流程

为在适用范围内，近红外光谱方法和近红外模型如何用于预期目的过程。在制定近红外方法流程时，应考虑以下内容：

（1）确定待测物、样品特性以及工艺流程等；

（2）原料或产品控制策略背景下工艺流程的预期目标，应包括近红外方法流程的操作范围限制，如分析物浓度、制造工艺参数和/或设计空间等；

（3）近红外光谱方法，即实现近红外检测的关键要素，包括采样接口、探头位置和采样计划等；

（4）近红外模型，包括相关的可接受标准和/或基于统计的质量属性阈值；

（5）总结信息，确保定期对近红外方法流程进行评估和再验证，以便在必要时进行持续改进和适当的变更控制；

（6）参考方法，应指定在近红外方法流程中，与所测量样品预测结果所对应的参考方法。