3516 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法（淋巴细胞毒试验）

3516 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法（淋巴细胞毒试验）
    本法系依据抗人T细胞免疫球蛋白与人淋巴细胞结合，在补体存在下破坏淋巴细胞，根据淋巴细胞死亡率测定供试品抗人T细胞免疫球蛋白效价。
    试剂  （1）淋巴细胞分离液（Ficoll’s液）。
    （2）Hank’s液。
    （3）20%胎牛血清Hank’s液  试验当天取适量经消毒保存的Hank’s液，加入经56℃、30分钟灭能的胎牛血清，配成20%浓度。用0.5mol/L碳酸氢钠溶液或稀盐酸调pH值至7.2~7.4。
    （4）淋巴细胞悬液  取肝素抗凝新鲜人静脉血加等量生理氯化钠溶液混匀后，缓慢加至等量淋巴细胞分离液液面上，以每分钟2000转离心20分钟，吸出淋巴细胞层细胞，加适量生理氯化钠溶液清洗，以每分钟1200转离心10分钟，弃上清液，沉淀加入适量20%胎牛血清Hank’s液，摇匀，为淋巴细胞原液；用1%醋酸蓝液将淋巴细胞原液稀释20倍，镜检计数淋巴细胞。根据计数结果，用20%胎牛血清Hank’s液将淋巴细胞原液稀释成每1ml含5×106个淋巴细胞，即为淋巴细胞悬液。
    （5）补体  采用正常家兔血清。作补体用的兔血清应对试验用的靶细胞无明显的毒性，因此家兔血清要预先进行选择，方法如下：取淋巴细胞悬液0.05ml，加1：5稀释的家兔血清0.05ml，置37℃、1小时后，加0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液0.05ml，置37℃、5分钟后镜检计数淋巴细胞，死亡细胞率在10%以下者方可作补体用。
    （6）0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液。
    （7）2.5%戊二醛溶液（用Hank’s液稀释）。
    供试品溶液的制备  根据供试品效价，用20%胎牛血清Hank’s液将供试品稀释至几个适宜浓度。
    阳性对照溶液的制备  将经人T淋巴细胞免疫的猪血浆或兔血清在60℃加热10分钟后，用生理氯化钠溶液稀释10倍。
    阴性对照溶液的制备  将正常猪血浆或兔血清在60℃加热10分钟后，用生理氯化钠溶液稀释10倍。
    测定法  取供试品溶液0.05ml，加淋巴细胞悬液0.05ml，置37℃、1小时，加1：5稀释的家兔血清0.05ml，置37℃、30分钟后加0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液0.05ml，置37℃、5分钟，立即镜检计数淋巴细胞，计算死亡细胞率，一般数100个淋巴细胞。取阳性对照溶液0.05ml，加淋巴细胞悬液0.05ml，自“置37℃、1小时”起，同法操作，作阳性对照。取阴性对照溶液0.05ml，加淋巴细胞悬液0.05ml，自“置37℃、1小时”起，同法操作，作阴性对照。
    结果判定  阳性对照组的死亡淋巴细胞率大于20%，且阴性对照组的死亡淋巴细胞率小于10%，试验成立。以（+）为判定终点，出现（+）供试品的最高稀释度为该供试品的淋巴细胞毒效价。
    【附注】（1）试验组死亡淋巴细胞率
    小于10%（-）	41%~60%（++）
    10%~20%（±）  61%~80%（+++）
    21%~40%（+）   不低于81%（++++）
    （2）如供试品较多或来不及看结果时，为避免试验误差，可在抗原、抗体、补体作用后加0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液0.05ml，置37℃、5分钟后，立即加2.5%戊二醛溶液0.05ml，留待适当时候镜检；或先加2.5%戊二醛溶液0.05ml，室温放置10分钟后，加入0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液0.05ml，置37℃，5分钟后留待适当时候镜检。