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3516 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(淋巴细胞毒试验)

来源:四部   分类:通则   页码:272  
3516 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(淋巴细胞毒试验)
本法系依据抗人T细胞免疫球蛋白与人淋巴细胞结合,在补体存在下破坏淋巴细胞,根据淋巴细胞死亡率测定供试品抗人T细胞免疫球蛋白效价。 试剂 (1)淋巴细胞分离液(Ficoll’s液)。 (2)Hank’s液。 (3)20%胎牛血清Hank’s液 试验当天取适量经消毒保存的Hank’s液,加入经56℃、30分钟灭能的胎牛血清,配成20%浓度。用0.5mol/L碳酸氢钠溶液或稀盐酸调pH值至7.2~7.4。 (4)淋巴细胞悬液 取肝素抗凝新鲜人静脉血加等量生理氯化钠溶液混匀后,缓慢加至等量淋巴细胞分离液液面上,以每分钟2000转离心20分钟,吸出淋巴细胞层细胞,加适量生理氯化钠溶液清洗,以每分钟1200转离心10分钟,弃上清液,沉淀加入适量20%胎牛血清Hank’s液,摇匀,为淋巴细胞原液;用1%醋酸蓝液将淋巴细胞原液稀释20倍,镜检计数淋巴细胞。根据计数结果,用20%胎牛血清Hank’s液将淋巴细胞原液稀释成每1ml含5×106个淋巴细胞,即为淋巴细胞悬液。 (5)补体 采用正常家兔血清。作补体用的兔血清应对试验用的靶细胞无明显的毒性,因此家兔血清要预先进行选择,方法如下:取淋巴细胞悬液0.05ml,加1:5稀释的家兔血清0.05ml,置37℃、1小时后,加0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液0.05ml,置37℃、5分钟后镜检计数淋巴细胞,死亡细胞率在10%以下者方可作补体用。 (6)0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液。 (7)2.5%戊二醛溶液(用Hank’s液稀释)。 供试品溶液的制备 根据供试品效价,用20%胎牛血清Hank’s液将供试品稀释至几个适宜浓度。 阳性对照溶液的制备 将经人T淋巴细胞免疫的猪血浆或兔血清在60℃加热10分钟后,用生理氯化钠溶液稀释10倍。 阴性对照溶液的制备 将正常猪血浆或兔血清在60℃加热10分钟后,用生理氯化钠溶液稀释10倍。 测定法 取供试品溶液0.05ml,加淋巴细胞悬液0.05ml,置37℃、1小时,加1:5稀释的家兔血清0.05ml,置37℃、30分钟后加0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液0.05ml,置37℃、5分钟,立即镜检计数淋巴细胞,计算死亡细胞率,一般数100个淋巴细胞。取阳性对照溶液0.05ml,加淋巴细胞悬液0.05ml,自“置37℃、1小时”起,同法操作,作阳性对照。取阴性对照溶液0.05ml,加淋巴细胞悬液0.05ml,自“置37℃、1小时”起,同法操作,作阴性对照。 结果判定 阳性对照组的死亡淋巴细胞率大于20%,且阴性对照组的死亡淋巴细胞率小于10%,试验成立。以(+)为判定终点,出现(+)供试品的最高稀释度为该供试品的淋巴细胞毒效价。 【附注】(1)试验组死亡淋巴细胞率 小于10%(-) 41%~60%(++) 10%~20%(±) 61%~80%(+++) 21%~40%(+) 不低于81%(++++) (2)如供试品较多或来不及看结果时,为避免试验误差,可在抗原、抗体、补体作用后加0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液0.05ml,置37℃、5分钟后,立即加2.5%戊二醛溶液0.05ml,留待适当时候镜检;或先加2.5%戊二醛溶液0.05ml,室温放置10分钟后,加入0.5%台盼蓝生理氯化钠溶液0.05ml,置37℃,5分钟后留待适当时候镜检。

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