3424 肝素含量测定法

3424 肝素含量测定法
    （凝固法）
    本法系依据硫酸鱼精蛋白能中和抗凝剂肝素，从而影响血浆凝固时间的原理，测定供试品中肝素含量。
    试剂  （1）缺血小板人血浆  无菌采集人全血于3.8%枸橼酸钠抗凝剂（体积比9：1）中，混匀，以每分钟1500转4℃离心30分钟，用塑料注射器取上层2/3的血浆，以每分钟3500转4℃离心30分钟，取上层2/3血浆，分装于塑料管中，每支3ml，-40℃保存备用。
    （2）三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（pH7.5）  称取三羟甲基氨基甲烷7.27g、氯化钠5.27g，加水溶解并稀释至1000ml（用盐酸调pH值至7.5）。
    （3）脑磷脂混悬液  冻干脑磷脂加水复溶，取适量，用生理氯化钠溶液稀释，稀释后的脑磷脂混悬液应使空白凝固时间在200~300秒。
    （4）0.025mol/L氯化钙溶液  称取氯化钙（CaCl2•2H2O）147g溶于1000ml水中，制成1mol/L氯化钙贮备液。临用时，用水将1mol/L氯化钙贮备液稀释40倍。
    （5）硫酸鱼精蛋白溶液  取硫酸鱼精蛋白适量，用pH7.5 Tris缓冲液溶解并稀释成每1ml含1~20mg的溶液。
    供试品溶液的制备  于每支含不同浓度的硫酸鱼精蛋白溶液10μl的塑料管中，分别加入按标示量复溶后的供试品0.5ml，混匀。
    测定法  在已含有缺血小板人血浆0.1ml的塑料管中，加入脑磷脂混悬液0.1ml，混匀，37℃放置1分钟，加供试品溶液0.1ml、已预热至37℃0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。用Tris缓冲液（pH7.5）0.1ml替代供试品溶液，同法操作，作空白对照。空白对照凝固时间不低于200秒，试验成立。取凝固时间最短的供试品管，作为硫酸鱼精蛋白中和0.5ml供试品中的肝素量。硫酸鱼精蛋白10μg中和1IU肝素。例如凝固时间最短的供试品管中含硫酸鱼精蛋白30μg，则中和供试品0.5ml中的肝素量为3IU，即供试品每1ml含6IU肝素。
    【附注】  （1）直接与血和血浆接触的器具应为塑料制品 或硅化的玻璃制品。
    （2）采用全自动凝血仪操作时，参考仪器使用说明书进行。