3423 活化的凝血因子活性检查法

3423 活化的凝血因子活性检查法
    本法系依据活化的凝血因子在脑磷脂存在下，使缺血小板人血浆发生凝固的原理，将供试品和缺血小板人血浆及脑磷脂混合，测定凝固时间，根据凝固时间判定供试品是否含有活化的凝血因子。
    试剂  （1）缺血小板人血浆  无菌采集人全血于3.8%枸橼酸钠抗凝剂（体积比9：1）中，混匀，以每分钟1500转4℃离心30分钟，用塑料注射器取上层2/3的血浆，以每分钟3500转4℃离心30分钟，取上层2/3血浆，分装于塑料管中，每支3ml，保存于-40℃备用。
    （2）三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（pH7.5）  称取三羟甲基氨基甲烷7.27g、氯化钠5.27g，加水溶解并稀释至1000ml（用盐酸调pH值至7.5）。
    （3）脑磷脂混悬液  冻干脑磷脂加水复溶，量取适量用生理氯化钠溶液稀释，稀释后的脑磷脂混悬液应使空白凝固时间在200~300秒。
    （4）0.025mol/L氯化钙溶液  称取氯化钙（CaCl2•2H2O）147g溶于1000ml水中，制成1mol/L氯化钙贮备液。临用时，用水将1mol/L氯化钙贮备液稀释40倍。
    （5）硫酸鱼精蛋白溶液  称取硫酸鱼精蛋白适量，用pH7.5的Tris缓冲液溶解并稀释成适宜浓度的溶液。
    供试品溶液的制备  取复溶后的供试品，根据测得的肝素含量（通则3424）加硫酸鱼精蛋白溶液适量，中和供试品中的肝素（10μg硫酸鱼精蛋白中和1IU肝素），再用Tris缓冲液（pH7.5）稀释10倍和100倍。
    测定法  取缺血小板人血浆0.1ml，加脑磷脂混悬液0.1ml，混匀，37℃放置1分钟，加供试品溶液（10倍或100倍稀释液）0.1ml、已预热至37℃的0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。用Tris缓冲液（pH7.5）0.1ml替代供试品溶液，同法操作，作空白对照。
    结果判定  空白对照凝固时间不低于200秒，试验成立。1：10和1：100供试品稀释液凝固时间均应不低于150秒。
    【附注】 （1）直接与血和血浆接触的器具应为塑料制品或硅化的玻璃制品。从供试品稀释到测定完毕应在30分钟内完成。
    （2）供试品每个稀释度做2管。