3418 抗毒素、抗血清制品鉴别试验

3418 抗毒素、抗血清制品鉴别试验
    （酶联免疫法）
    本法系采用酶联免疫法检查抗毒素、抗血清制品的蛋白质成分。
    试剂  （1）包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液）  称取碳酸钠0.32g、碳酸氢钠0.586g，加水溶解并稀释至200ml。
    （2）磷酸盐缓冲液（pH7.4）  称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.44g、磷酸二氢钾0.24g， 加水溶解并稀释至1000ml， 121℃灭菌15分钟。
    （3）洗涤液（PBS-Tween20）  量取聚山梨酯20 0.5ml， 加磷酸盐缓冲液至1000ml。
    （4）封闭液  称取牛血清白蛋白2.0g，加洗涤液溶解并稀释至100ml。
    （5）稀释液  称取牛血清白蛋白0.5g，加洗涤液溶解并稀释至100ml。
    （6）底物缓冲液（0.005mol/L醋酸钠-枸橼酸缓冲液）  称取醋酸钠0. 68g，枸橼酸（C6H8O7•H2O）1.05g，加水溶解并稀释至1000ml，调pH值至3.6。
    （7）底物液A  称取3，3'，5，5'-四甲基联苯胺0.088，加二甲基亚砜40ml溶解，加甲醇60ml，混匀，加底物缓冲液100ml，避光搅拌2小时至完全溶解，避光室温静置4小时。
    （8）底物液B  量取1.5%过氧化氢溶液3.2ml，加底物缓冲液稀释至1000ml。
    （9）底物液  取底物液A、底物液B等体积混匀。临用前配制。
    （10）终止液  2mol/L硫酸溶液。
    阴性对照、阳性对照的制备  用马IgG作阳性对照，用人IgG、牛IgG、羊IgG、猪IgG作阴性对照，取阴性对照、阳性对照，用包被液稀释至适宜浓度。
    供试品溶液的制备  取供试品适量，用包被液稀释成5~10μg/ml。
    测定法  取供试品溶液及对照溶液，分别以100μl/孔加至酶标板内，供试品溶液及对照溶液均做双孔，用封口膜封好，2~8℃放置16~20小时；用洗涤液洗板3次，用封闭液200μl/孔加至酶标板内，用封口膜封好，37℃放置1小时；将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次，用稀释液按1：2000稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗马IgG抗体，以100μl/孔加至酶标板内，用封口膜封好，37℃放置1小时；用洗涤液洗板6次，以100μl/孔加入底物液，室温避光放置5~15分钟；以100μl/孔加入终止液终止反应。用酶标仪在波长450nm处测定吸光度。
    结果判定  取4种阴性对照中吸光度最高的计算Cutoff值，Cutoff值为阴性对照吸光度（2孔平均值）的2.1倍。阳性对照的吸光度大于Cutoff值则试验成立，供试品吸光度大于Cutoff值时为阳性，表示供试品与马IgG同源。