3404 免疫电泳法

3404 免疫电泳法
    本法系将供试品通过电泳分离成区带的各抗原，然后与相应的抗体进行双相免疫扩散，当两者比例合适时形成可见的沉淀弧。将沉淀弧与已知标准抗原、抗体生成的沉淀弧的位置和形状进行比较，即可分析供试品中的成分及其性质。
    试剂 （1）巴比妥缓冲液（pH8.6） 称取巴比妥4.14g与巴比妥钠23.18g，加适量水，加热使溶解，冷却至室温， 再加叠氮钠0.15g，加水使溶解成1500ml。
    （2）0.5%氨基黑染色剂 称取氨基黑10B 0.5g，加甲醇50ml、冰醋酸10ml与水40ml的混合液，溶解。
    （3）1.5%琼脂糖溶液 称取琼脂糖1.5g，加水50ml与巴比妥缓冲液50ml，加热使溶胀完全。
    （4）脱色液 量取乙醇45ml、冰醋酸5ml与水50ml，混合均匀。
    （5）溴酚蓝指示液 称取溴酚蓝50mg，加水使溶解成 100ml。
    对照品 正常人血清或其他适宜的对照品。
    供试品溶液的制备 用生理氯化钠溶液将供试品蛋白质浓度稀释成0.5%。
    检查法 将1.5%琼脂糖溶液倾倒于大小适宜的水平玻板上，厚度约3mm，静置，待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层后，于琼脂糖凝胶板负极1/3处的上下各打1孔，孔径3mm，孔距10～15mm。测定孔加供试品溶液10μl和溴酚蓝指示液1滴，对照孔加正常人血清或人血浆10μl和溴酚蓝指示液1滴。用3层滤纸搭桥和巴比妥缓冲液（电泳缓冲液）接触，100V恒压电泳约2小时（指示剂迁移到前沿）。电泳结束后，在两孔之间距离两端3～5mm处挖宽3mm槽，向槽中加入血清抗体或人血浆抗体，槽满但不溢出。放湿盒中37℃扩散24小时。扩散完毕后，用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板，以除去未结合蛋白质。将浸泡好的琼脂糖凝胶板放入0.5%氨基黑溶液染色，再用脱色液脱色至背景基本无色。用适当方法保存或复制图谱。与对照品比较，供试品的主要沉淀线应为待测蛋白质。
    注意事项 （1）电泳时应有冷却系统，否则琼脂糖凝胶会出现干裂。
    （2）用生理氯化钠溶液浸泡应充分，否则背景不清晰。