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3401 免疫印迹法

来源:四部   分类:通则   页码:248  
3401 免疫印迹法
本法系以供试品与特异性抗体结合后,抗体再与酶标抗体特异性结合,通过酶学反应的显色,对供试品的抗原特异性进行检查。 试剂 (1)TG缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷15.12g与甘氨酸72g,加水溶解并稀释至500ml。4℃保存。 (2)EBM缓冲液 量取TG缓冲液20ml、甲醇40ml,加水稀释至200ml。4℃保存。 (3)TTBS缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷6.05g与氯化钠4.5g,量取聚山梨酯80 0.55ml,加适量水溶解,用盐酸调pH值至7.5,加水稀释至500ml。4℃保存。 (4)底物缓冲液 称取3,3'-二氨基联苯胺盐酸盐15mg, 加甲醇5ml与30%过氧化氢15μl,加TTBS缓冲液25ml使溶解,即得。临用现配。 检查法 照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(通则0541第五法),供试品与阳性对照品上样量应大于100ng。取出凝胶,切去凝胶边缘,浸于EBM缓冲液中30分钟。另取与凝胶同样大小的厚滤纸6张、硝酸纤维素膜1张,用EBM缓冲液浸透。用半干胶转移仪进行转移:在电极板上依次放上湿滤纸3张、硝酸纤维素膜1张、电泳凝胶、湿滤纸3张,盖上电极板,按0.8mA/cm2硝酸纤维素膜恒电流转移45分钟。 取出硝酸纤维素膜浸入封闭液(10%新生牛血清的TTBS缓冲液,或其他适宜封闭液)封闭60分钟。弃去液体,加入TTBS缓冲液10ml,摇动加入适量的供试品抗体(参考抗体使用说明书的稀释度稀释),室温过夜。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次,再用TTBS缓冲液浸洗3次,每次8分钟。弃去液体,再加入TTBS缓冲液10ml,摇动加入适量的生物素标记的第二抗体,室温放置40分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次,再用TTBS缓冲液浸洗3次,每次8分钟。弃去液体,更换TTBS缓冲液10ml,摇动,加入适量的亲和素溶液和生物素标记的辣根过氧化物酶溶液,室温放置60分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次,再用TTBS缓冲液浸洗4次,每次8分钟。弃去液体,加入适量底物缓冲液,置于室温避光条件下显色,显色程度适当时水洗终止反应。 结果判定 阳性结果应呈现明显色带。阴性结果不显色。

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