3401 免疫印迹法

3401 免疫印迹法
    本法系以供试品与特异性抗体结合后，抗体再与酶标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。
    试剂 （1）TG缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷15.12g与甘氨酸72g，加水溶解并稀释至500ml。4℃保存。
    （2）EBM缓冲液 量取TG缓冲液20ml、甲醇40ml，加水稀释至200ml。4℃保存。
    （3）TTBS缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷6.05g与氯化钠4.5g，量取聚山梨酯80 0.55ml，加适量水溶解，用盐酸调pH值至7.5，加水稀释至500ml。4℃保存。
    （4）底物缓冲液 称取3，3'-二氨基联苯胺盐酸盐15mg， 加甲醇5ml与30%过氧化氢15μl，加TTBS缓冲液25ml使溶解，即得。临用现配。
    检查法 照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（通则0541第五法），供试品与阳性对照品上样量应大于100ng。取出凝胶，切去凝胶边缘，浸于EBM缓冲液中30分钟。另取与凝胶同样大小的厚滤纸6张、硝酸纤维素膜1张，用EBM缓冲液浸透。用半干胶转移仪进行转移：在电极板上依次放上湿滤纸3张、硝酸纤维素膜1张、电泳凝胶、湿滤纸3张，盖上电极板，按0.8mA/cm2硝酸纤维素膜恒电流转移45分钟。
    取出硝酸纤维素膜浸入封闭液（10%新生牛血清的TTBS缓冲液，或其他适宜封闭液）封闭60分钟。弃去液体，加入TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的供试品抗体（参考抗体使用说明书的稀释度稀释），室温过夜。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟。弃去液体，再加入TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的生物素标记的第二抗体，室温放置40分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟。弃去液体，更换TTBS缓冲液10ml，摇动，加入适量的亲和素溶液和生物素标记的辣根过氧化物酶溶液，室温放置60分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗4次，每次8分钟。弃去液体，加入适量底物缓冲液，置于室温避光条件下显色，显色程度适当时水洗终止反应。
    结果判定 阳性结果应呈现明显色带。阴性结果不显色。