3304 SV40核酸序列检查法

3304 SV40核酸序列检查法
    本法系通过设计2对特异引物扩增SV40 VP1 l00bp （2220～2319）和大T抗原C端 451bp（2619～3070） 2个片段，采用PCR检查供试品中是否存在SV40核酸序列。
    供试品溶液及对照溶液的制备 取供试品400μl，加2%蛋白酶K溶液 25μl、10%SDS溶液50μl、0.05mol/L EDTA溶液（pH8.0）10μl，置56℃培养1小时，用等体积的酚-三氯甲烷（1：1）混合液抽提后，再用等体积的三氯甲烷抽提，加2倍体积的乙醇，-20℃放置16小时，以每分钟10000转离心15分钟，沉淀用75%乙醇溶液洗涤干燥，加无DNA酶和RNA酶的水10μl，使溶解。阳性对照及阴性对照按上述方法与供试品同时处理。
    引物
    VP1 上游引物：2220 5'-ACA CAG CAA CCA CAG TGG TTC-3'2240
    VP1 下游引物：2319 5'-GTA AAC AGC CCA CAA ATG TCA AC-3'2297
    T 抗原 C 端上游引物：3070 5'-GAC CTG TGG CTG AGT TTG CTC A-3' 3049
    T抗原C端下游引物：2619 5'GCT TTA TTT GTA ACC ATT ATA AG-3' 2641
    检查法 （1）每个待扩增的供试品引物加量为30×10-12mol， DNA模板加量为1μl，总体积50μl。在PCR仪上以94℃先变性3分钟，然后94℃变性20秒、50℃退火20秒、72℃延伸40秒，共进行40个循环；72℃延伸3分钟。
    （2）扩增产物电泳检查 2%琼脂糖凝胶（每1ml含1μg溴化乙锭），缓冲液为1×TAE，在100V条件下电泳40分钟，检查扩增片段。VP1扩增片段为100bp，大T抗原C端片段为451bp。
    （3）以同样模板重复扩增VP1片段，排除污染因素导致的非特异扩增；或将扩增产物及对照从胶上移至Hybond N 尼龙膜上，与VP1探针进行免疫印迹试验，以证明所扩增片段确为VP1片段。
    （4）以自动测序仪对供试品及阳性对照的大T抗原C端扩增产物进行序列测定。
    结果判定 阳性对照应得到特异产物，阴性对照应无相应片段，则试验成立。
    若未能扩增出VP1片段，则结果判定为未检出SV40核酸序列。
    若扩增出VP1片段，可重复试验1次，仍未扩增出VP1片段者，判定为未检出SV40核酸序列。
    若重试仍能扩增出VP1片段，则应扩增大T抗原C端片段，如扩增出大T抗原C端片段，应将其扩增产物和阳性对照扩增产物进行测序并比较，核酸序列一致判定为检出SV40核酸序列；如未扩增出大T抗原C端片段，则可按上述步骤（1）～（3）重复试验1次，如仍未扩增出大T抗原C端片段，则可判定为未检出SV40核酸序列。