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3532 重组人白介素-11生物学活性测定法

来源:三部   分类:三部通则   页码:535  
3532 重组人白介素-11生物学活性测定法
(B9-11细胞/MTT比色法) 本法系根据源于小鼠B9杂交瘤的亚克隆细胞株(B9-11细胞株)在不同人白介素-11(IL-11)的浓度下增殖速度的不同,检测重组人白介素-11的生物学活性。 试剂 (1)RPMI 1640培养液 取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L),加超纯水溶解并稀释至1000ml,再加NaHCO3 2.1g,溶解后,混匀,除菌过滤,4℃保存。 (2)完全培养液 取RPMI 1640细胞培养液900ml,加入新生牛血清100ml,加rhIL-11至终浓度50单位/ml,4℃保存。. (3)测活培养液 取RPMI 1640细胞培养液950ml,加入胎牛血清50ml。 (4)PBS 称取NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g,加超纯水溶解至1000ml,经121℃、15分钟灭菌。 (5)噻唑蓝(MTT)溶液 取MTT粉末0.10g,溶于PBS 20ml中,配成每1ml含5.0mg的溶液,经0.22μm滤膜过滤除菌,4℃避光保存。 (6)裂解液 分析纯二甲基亚砜(DMSO)或含0.01mol/L盐酸的10%SDS水溶液。 标准品溶液的制备 取重组人白介素-11生物学活性测定标准品,按照说明书复溶后,用基础培养液稀释至每1ml含1000单位或适宜浓度。在96孔细胞培养板中,做4倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2个孔,每孔分别留50μl标准品溶液,弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。 供试品溶液的制备 将供试品用基础培养液稀释成约每1ml含1000单位或适宜浓度。在96孔细胞培养板中,做4倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2个孔,每孔分别留50μl供试品溶液,弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。 测定法 B9-11细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养,传代后24~72小时用于生物学活性测定。将试验所用溶液预温至37℃。取足量B9-11细胞培养物,离心收集细胞,用RPMI 1640培养液洗涤3次,然后重悬于基础培养液,配成每1ml含2.0×105~3.0×105个细胞的细胞悬液(根据细胞状态可适当调整接种密度),置37℃备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中每孔加入50μl细胞悬液,于37℃、5%二氧化碳条件下培养40~48小时。每孔加入MT丁溶液20μl,于℃、5%二氧化碳条件下培养4~5小时。以上操作在无菌条件下进行。每孔加入裂解液100μl,混匀(SDS过夜)后(以0.01mol/L盐酸的10%SDS做裂解时,需放置适宜时间),放入酶标仪,以630nm为参比波长,于波长570nm处测定吸光度,记录测定结果。 试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理,并按下式计算结果: Ds×Es 供试品生物学活性(U/ml)=Pr× ——————— Dr×Er 式中 Pr为标准品生物学活性,U/ml; Ds为供试品预稀释倍数; Dr为标准品预稀释倍数; Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数; Er为标准品半效量的稀释倍数。

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