3532 重组人白介素-11生物学活性测定法

3532 重组人白介素-11生物学活性测定法
    （B9-11细胞/MTT比色法）
    本法系根据源于小鼠B9杂交瘤的亚克隆细胞株（B9-11细胞株）在不同人白介素-11（IL-11）的浓度下增殖速度的不同，检测重组人白介素-11的生物学活性。
    试剂  （1）RPMI 1640培养液 取RPMI 1640培养基粉末1袋（规格为1L），加超纯水溶解并稀释至1000ml，再加NaHCO3 2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。
    （2）完全培养液  取RPMI 1640细胞培养液900ml，加入新生牛血清100ml，加rhIL-11至终浓度50单位/ml，4℃保存。.
    （3）测活培养液  取RPMI 1640细胞培养液950ml，加入胎牛血清50ml。
    （4）PBS  称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，加超纯水溶解至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。
    （5）噻唑蓝（MTT）溶液  取MTT粉末0.10g，溶于PBS 20ml中，配成每1ml含5.0mg的溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存。
    （6）裂解液  分析纯二甲基亚砜（DMSO）或含0.01mol/L盐酸的10%SDS水溶液。
    标准品溶液的制备  取重组人白介素-11生物学活性测定标准品，按照说明书复溶后，用基础培养液稀释至每1ml含1000单位或适宜浓度。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
    供试品溶液的制备  将供试品用基础培养液稀释成约每1ml含1000单位或适宜浓度。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
    测定法  B9-11细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养，传代后24~72小时用于生物学活性测定。将试验所用溶液预温至37℃。取足量B9-11细胞培养物，离心收集细胞，用RPMI 1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液，配成每1ml含2.0×105~3.0×105个细胞的细胞悬液（根据细胞状态可适当调整接种密度），置37℃备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中每孔加入50μl细胞悬液，于37℃、5%二氧化碳条件下培养40~48小时。每孔加入MT丁溶液20μl，于℃、5%二氧化碳条件下培养4~5小时。以上操作在无菌条件下进行。每孔加入裂解液100μl，混匀（SDS过夜）后（以0.01mol/L盐酸的10%SDS做裂解时，需放置适宜时间），放入酶标仪，以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
    试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果：
                                  Ds×Es    
    供试品生物学活性（U/ml）=Pr× ———————
                                   Dr×Er
    式中  Pr为标准品生物学活性，U/ml；
    Ds为供试品预稀释倍数；
    Dr为标准品预稀释倍数；
    Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
    Er为标准品半效量的稀释倍数。