3530 鼠神经生长因子生物学活性测定法

3530 鼠神经生长因子生物学活性测定法
    第一法  鸡胚背根神经节培养法
    试剂  （1）鼠尾胶  大鼠鼠尾用75%乙醇消毒后，分离出尾腱，剪碎，浸泡于0.1%冰醋酸溶液中溶解48小时，4℃、每分钟4000转离心30分钟，取上清液，-20℃保存。
    （2）DMEM培养液  取DMEM培养液，加入终浓度为100lU/ml青霉素、100lU/ml链霉素和2mmol/L L-谷氨酰胺，混匀。
    （3）基础培养液  量取胎牛血清（FBS）10ml，加DMEM培养液90ml，4℃保存。
    标准品溶液和供试品溶液的制备  取鼠神经生长因子生物学活性测定的国家标准品，用DMEM培养液做3倍系列稀释，共5~6个稀释度。取供试品做相同稀释。
    测定法  取7~9天的鸡胚，洁净条件下取出背根神经节，分置于涂有鼠尾胶的培养瓶中，贴壁1~2小时后，加入不同稀释度的标准品溶液和供试品溶液，并设阴性对照瓶，于37℃、含5%二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养24小时，用倒置显微镜观察神经节轴突生长情况，以引起++++生长的最高稀释度为判定终点，按下式计算供试品的生物学活性单位。
                                                 供试品终点稀释倍数
    供试品的活性单位（AU/ml）=标准品生物学活性×—————————————————————— 
                                                 标准品琢点稀释倍数
    【附注】神经节轴突生长判定标准
    “#”：神经节生长过量抑制；
    “++++”：神经节突起长满四周，又长又密，呈树杈状；
    “+++”：神经节突起长满2/3周，呈树杈状；
    “++”：神经节突起长满1/2周；
    “+”：神经节突起只有几根；
    “-”：无突起生长。
    
    第二法  TF-1细胞/MTS比色法
    本法系依据人红细胞白血病细胞（简称TF-1细胞）的生长状况因鼠神经生长因子（NGF）生物学活性的不同而不同，以此检测NGF的生物学活性。本法为仲裁法。
    试剂  （1）RPMI 1640培养液  取市售RPMI 1640培养液，加入终浓度为100lU/ml青霉素和100IU/ml链霉素。
    （2）基础培养液  量取胎牛血清（FBS）100ml，加入RPMI 1640培养液900ml中。4℃保存。
    （3）完全培养液  基础培养液添加鼠神经生长因子至终浓度为每1ml含12U。
    （4）MTS溶液  取市售的MTS于4℃融化，1.2ml/支分装到EP管中，并避光保存于-20℃。
    （5）TF-1细胞  TF-1细胞株用完全培养基于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×105~5.0×105个细胞，传代后24小时用于NGF生物学活性测定。
    标准品溶液的制备  取鼠神经生长因子生物学活性测定的国家标准品，按说明书复溶后，用基础培养液稀释至每1ml含100U或适宜浓度（每步稀释不超过10倍）。在96孔细胞培养板中，做3倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔分别留100μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在洁净条件下进行。
    供试品溶液的制备  将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释至每1ml约含100U（每步稀释不超过10倍）。在96孔细胞培养板中，做3倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔分别留100μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在洁净条件下进行。
    测定法  TF-1细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×105~5.0×105个细胞，传代后24小时用于生物学活性测定。将试验所用溶液预温至37℃。取足量TF-1细胞培养物，离心收集TF-1细胞，用基础培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液配成每1ml含6.0×104个细胞的细胞悬液，置于37℃、5%二氧化碳条件下备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液100μl，于37°℃、5%二氧化碳条件下培养66~72小时。每孔加入MTS溶液20μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养3小时。以上操作在无菌条件下进行。放人酶标仪，以550nm为参比波长[1]，在波长490nm处测定吸光度，记录测定结果。
    试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果：
                                  Ds×Es    
    供试品生物学活性（U/ml）=Pr× ———————
                                   Dr×Er
    式中  Pr为标准品生物学活性，U/ml；
    Ds为供试品预稀释倍数；
    Dr为标准品预稀释倍数；
    Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
    Er为标准品半效量的稀释倍数。