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3530 鼠神经生长因子生物学活性测定法

来源:三部   分类:三部通则   页码:533  
3530 鼠神经生长因子生物学活性测定法
第一法 鸡胚背根神经节培养法 试剂 (1)鼠尾胶 大鼠鼠尾用75%乙醇消毒后,分离出尾腱,剪碎,浸泡于0.1%冰醋酸溶液中溶解48小时,4℃、每分钟4000转离心30分钟,取上清液,-20℃保存。 (2)DMEM培养液 取DMEM培养液,加入终浓度为100lU/ml青霉素、100lU/ml链霉素和2mmol/L L-谷氨酰胺,混匀。 (3)基础培养液 量取胎牛血清(FBS)10ml,加DMEM培养液90ml,4℃保存。 标准品溶液和供试品溶液的制备 取鼠神经生长因子生物学活性测定的国家标准品,用DMEM培养液做3倍系列稀释,共5~6个稀释度。取供试品做相同稀释。 测定法 取7~9天的鸡胚,洁净条件下取出背根神经节,分置于涂有鼠尾胶的培养瓶中,贴壁1~2小时后,加入不同稀释度的标准品溶液和供试品溶液,并设阴性对照瓶,于37℃、含5%二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养24小时,用倒置显微镜观察神经节轴突生长情况,以引起++++生长的最高稀释度为判定终点,按下式计算供试品的生物学活性单位。 供试品终点稀释倍数 供试品的活性单位(AU/ml)=标准品生物学活性×—————————————————————— 标准品琢点稀释倍数 【附注】神经节轴突生长判定标准 “#”:神经节生长过量抑制; “++++”:神经节突起长满四周,又长又密,呈树杈状; “+++”:神经节突起长满2/3周,呈树杈状; “++”:神经节突起长满1/2周; “+”:神经节突起只有几根; “-”:无突起生长。 第二法 TF-1细胞/MTS比色法 本法系依据人红细胞白血病细胞(简称TF-1细胞)的生长状况因鼠神经生长因子(NGF)生物学活性的不同而不同,以此检测NGF的生物学活性。本法为仲裁法。 试剂 (1)RPMI 1640培养液 取市售RPMI 1640培养液,加入终浓度为100lU/ml青霉素和100IU/ml链霉素。 (2)基础培养液 量取胎牛血清(FBS)100ml,加入RPMI 1640培养液900ml中。4℃保存。 (3)完全培养液 基础培养液添加鼠神经生长因子至终浓度为每1ml含12U。 (4)MTS溶液 取市售的MTS于4℃融化,1.2ml/支分装到EP管中,并避光保存于-20℃。 (5)TF-1细胞 TF-1细胞株用完全培养基于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养,控制细胞浓度为每1ml含1.0×105~5.0×105个细胞,传代后24小时用于NGF生物学活性测定。 标准品溶液的制备 取鼠神经生长因子生物学活性测定的国家标准品,按说明书复溶后,用基础培养液稀释至每1ml含100U或适宜浓度(每步稀释不超过10倍)。在96孔细胞培养板中,做3倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔,每孔分别留100μl标准品溶液,弃去孔中多余溶液。以上操作在洁净条件下进行。 供试品溶液的制备 将供试品按标示量复溶后,用基础培养液稀释至每1ml约含100U(每步稀释不超过10倍)。在96孔细胞培养板中,做3倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔,每孔分别留100μl标准品溶液,弃去孔中多余溶液。以上操作在洁净条件下进行。 测定法 TF-1细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养,控制细胞浓度为每1ml含1.0×105~5.0×105个细胞,传代后24小时用于生物学活性测定。将试验所用溶液预温至37℃。取足量TF-1细胞培养物,离心收集TF-1细胞,用基础培养液洗涤3次,然后重悬于基础培养液配成每1ml含6.0×104个细胞的细胞悬液,置于37℃、5%二氧化碳条件下备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液100μl,于37°℃、5%二氧化碳条件下培养66~72小时。每孔加入MTS溶液20μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养3小时。以上操作在无菌条件下进行。放人酶标仪,以550nm为参比波长[1],在波长490nm处测定吸光度,记录测定结果。 试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理,并按下式计算结果: Ds×Es 供试品生物学活性(U/ml)=Pr× ——————— Dr×Er 式中 Pr为标准品生物学活性,U/ml; Ds为供试品预稀释倍数; Dr为标准品预稀释倍数; Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数; Er为标准品半效量的稀释倍数。
勘误:
  • [1] 以650nm为参比波长 (2016-2-22)

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