3527 重组牛碱性成纤维细胞生长因子生物学活性测定法

3527 重组牛碱性成纤维细胞生长因子生物学活性测定法
    （细胞增殖法/MTT比色法）
    本法系依据重组牛碱性成纤维细胞生长因子对小鼠胚胎成纤维细胞（BALB/c 3T3细胞）的生长具有刺激作用，BALB/c 3T3细胞的生长状况因重组牛碱性成纤维细胞生长因子生物学活性的不同而不同，以此检测重组牛碱性成纤维细胞生长因子的生物学活性。
    试剂  （1）RPMI  1640培养液  取RPMI 1640培养基粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素105IU和链霉素105IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。
    （2）维持培养液  量取新生牛血清4ml，加RPMI 1640培养液至1000ml。
    （3）完全培养液  量取新生牛血清100ml，加RPMI 1640培养液至1000ml。
    （4）PBS  称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。
    （5）噻唑蓝（MTT）溶液  称取MTT粉末0.10g，加PBS 20ml使溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。
    标准品溶液的制备  取重组牛碱性成纤维细胞生长因子标准品，按说明书复溶后，用维持培养液稀释至每1ml含40IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。以上操作在无菌条件下进行。
    供试品溶液的制备  将供试品按标示量复溶后，用维持培养液稀释成每1ml约含40IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。以上操作在无菌条件下进行。
    测定法  BALB/c 3T3细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×105~5.0×105个细胞，传代后24~36小时用于生物学活性测定。弃去培养瓶中的培养液，消化并收集细胞，用完全培养液配成每1ml含5.010^4~1.0×105个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养。24小时后换成维持培养液，于37℃、5%二氧化碳条件下培养24小时。制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养64~72小时。每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养5小时。以上步骤在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入二甲基亚砜100μl，混匀后，放入酶标仪，以630mn为参比波长，在波长570mn处测定吸光度，记录测定结果。试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处
    理，并按下式计算结果：
                                  Ds×Es    
    供试品生物学活性（IU/ml）=Pr× ———————
                                   Dr×Er
    式中  Pr为标准品生物学活性，IU/ml；
    Ds为供试品预稀释倍数；
    Dr为标准品预稀释倍数；
    Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
    Er为标准品半效量的稀释倍数。
    注：显色方法也可采用经等效验证的其他显色方法。