3526 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子生物学活性测定法

3526 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子生物学活性测定法
    （TF-1细胞/MTT比色法）
    本法系依据人红细胞白血病细胞（简称TF-1细胞）的生长状况因重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子（GM-CSF）生物学活性的不同而不同，以此检测GM-CSF的生物学活性。
    试剂  （1）RPMI 1640培养液取RPMI 1640培养基粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素105IU和链霉素105IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。
    （2）基础培养液  量取新生牛血清100ml，加入RPMI 1640培养液900ml中。4℃保存。
    （3）完全培养液  基础培养液加重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子至终浓度为每1ml约含5.0ng或每1ml约含80IU。
    （4）PBS  称取氯化钠8g、氯化钟0.2g，磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。
    （5）噻唑蓝（MTT）溶液  称取MTT粉末0.10g，溶于PBS 20ml中，配制成每1ml含5mg的溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。
    （6）裂解液  量取盐酸14ml、Triton X-100溶液50ml，加异丙醇配制成500ml的溶液。
    标准品溶液的制备  取重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子标准品，按说明书复溶后，用基础培养液稀释至每1ml含10~20IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
    供试品溶液的制备  将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释成每1ml含10~20IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
    测定法  TF-1细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含2.0~×1057.0×105个细胞，传代后24~36小时用于生物学活性测定。将试验所用溶液预温至37℃。取足量TF-1细胞培养物，离心并收集TF-1细胞，用基础培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液中，配成每1ml含4.0×105个细胞的细胞悬液，置37℃备用。向加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中加入细胞悬液，每孔50μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养48~52小时后，每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养5小时，以上操作在无菌条件下进行。再向上述各孔加裂解液100μl，混匀后，放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570mn处测定吸光度，记录测定结果。
    试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果：
                                  Ds×Es    
    供试品生物学活性（IU/ml）=Pr× ———————
                                   Dr×Er
    式中  Pr为标准品生物学活性，IU/ml；
    Ds为供试品预稀释倍数；
    Dr为标准品预稀释倍数；
    Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
    Er为标准品半效量的稀释倍数。
    注：显色方法也可采用经等效验证的其他显色方法。