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3525 重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定法

来源:三部   分类:三部通则   页码:530  
3525 重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定法
(NFS-60细胞/MTT比色法) 本法系依据小鼠骨髄白血病细胞(NFS-60细胞)的生长状况因重组人粒细胞刺激因子(G-CSF)生物学活性的不同而不同,以此检测G-CSF的生物学活性。 试剂 (1)RPMI 1640培养液 取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L),加水溶解并稀释至1000ml,加青霉素105IU和链霉素105IU,再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀,除菌过滤,保存。 (2)基础培养液 量取新生牛血清100ml,加入RPMI 1640培养液900ml中。4℃保存。 (3)完全培养液 基础培养液中加入重组人粒细胞刺激因子至最终浓度为每1ml含10~20ng。 (4)PBS 称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至1000ml,经121℃、15分钟灭菌。 (5)噻唑蓝(MTT)溶液 称取MTT粉末0.10g,溶于PBS 20ml中,配制成每1ml含5.0mg的溶液,,经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。 (6)裂解液 量取盐酸14ml、Triton X-100溶液50ml,加异丙醇,配制成500ml的溶液。室温避光保存。 标准品溶液的制备 取重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定标准品,按说明书复溶后,用基础培养液稀释至 每1ml含50~300IU。在96孔细胞培养板中,做2倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔,每孔分别留50μl标准品溶液,弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。 供试品溶液的制备 将供试品按标示量复溶后,用基础培养液稀释成每1ml含50~300IU。在96孔细胞培养板中,做2倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔,每孔分别留50μl供试品溶液,弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。 测定法 NFS-60细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养,控制细胞浓度为每1ml含1.0×105~4.0×105个细胞,传代后24~36小时用于生物学活性测定。将试验所用溶液预温至37℃。取足量NFS-60细胞培养物,离心收集NFS-60细胞,用RPMI 1640培养液洗涤3次,然后重悬于基础培养液配成每1ml含2.0×105个细胞的细胞悬液,置37℃备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液50μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养40~48小时。每孔加入MTT溶液20μl,于37℃、二氧化碳条件下培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。每孔加入裂解液100μl,混匀后,放入酶标仪,以630nm为参比波长,在波长570nm处测定吸光度,记录测定结果。 试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理,并按下式计算结果: Ds×Es 供试品生物学活性(IU/ml)=Pr× ——————— Dr×Er 式中 Pr为标准品生物学活性,IU/ml; Ds为供试品预稀释倍数; Dr为标准品预稀释倍数; Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数; Er为标准品半效量的稀释倍数。 注:显色方法也可采用经等效验证的其他显色方法。

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