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3524 重组人白介素-2生物学活性测定法

来源:三部   分类:三部通则   页码:530  
3524 重组人白介素-2生物学活性测定法
(CTLL-2细胞/MTT比色法) 本法系依据在不同白介素-2(IL-2)的浓度下,其细胞依赖株CTLL-2细胞存活率不同,以此检测IL-2的生物学活性。 试剂 (1)RPMI 1640培养液 取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L),加水溶解并稀释至1000ml,加青霉素105IU和链霉素105IU,再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀,除菌过滤,4℃保存。 (2)基础培养液 量取新生牛血清(FBS)10ml,加RPMI 1640培养液90ml。4℃保存。 (3)完全培养液 量取基础培养液100ml,加重组人白介素-2至终浓度为每1ml含400~800IU。4℃保存。 (4)PBS 称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至1000ml,经121℃、15分钟灭菌。 (5)噻唑蓝(MTT)溶液称取MTT0.1g,加PBS溶解并稀释至20ml,经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。 (6)裂解液 15%十二烷基硫酸钠溶液,使用期限不得超过12个月。 CTLL-2细胞 应为偏酸性、略微浑浊液体,传代后48~60小时用于重组人白介素-2生物学活性测定。 标准品溶液的制备 取重组人白介素-2生物学活性测定的国家标准品,按使用说明书复溶后,用基础培养液稀释至每1ml含200IU。在96孔细胞培养板中,做2倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔。每孔分别留50μl标准品溶液,弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。 供试品溶液的制备 将供试品按标示量复溶后,用基础培养液稀释成每1ml约含200IU。在96孔细胞培养板中,做2倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔。每孔分别留50μl供试品溶液,弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。 测定法 CTLL-2细胞用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养至足够量,离心收集CTLL-2细胞,用RPMI 1640培养液洗涤3次,然后重悬于基础培养液中配制成每1ml含6.0×105个细胞的细胞悬液,于37℃、5%二氧化碳条件下备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中,每孔加入细胞悬液50μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养18~24小时;然后每孔加入MTT溶液20μl,于37℃、5%二氧化碳条件下培养4~6小时后,每孔加入裂解液150μl,于37℃、5%二氧化碳条件下保温18~24小时。以上操作均在无菌条件下进行。混匀细胞板中的液体,放人酶标仪,以630nm为参比波长,在波长570nm处测定吸光度,记录测定结果。 试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理,并按下式计算结果: Ds×Es 供试品生物学活性(IU/ml)=Pr× ——————— Dr×Er 式中 Pr为标准品生物学活性,IU/ml; Ds为供试品预稀释倍数; Dr为标准品预稀释倍数; Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数; Er为标准品半效量的稀释倍数。 注:显色方法也可采用经等效验证的其他显色方法。

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