3524 重组人白介素-2生物学活性测定法

3524 重组人白介素-2生物学活性测定法
    （CTLL-2细胞/MTT比色法）
    本法系依据在不同白介素-2（IL-2）的浓度下，其细胞依赖株CTLL-2细胞存活率不同，以此检测IL-2的生物学活性。
    试剂  （1）RPMI 1640培养液 取RPMI 1640培养基粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素105IU和链霉素105IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。
    （2）基础培养液  量取新生牛血清（FBS）10ml，加RPMI 1640培养液90ml。4℃保存。
    （3）完全培养液  量取基础培养液100ml，加重组人白介素-2至终浓度为每1ml含400~800IU。4℃保存。
    （4）PBS  称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。
    （5）噻唑蓝（MTT）溶液称取MTT0.1g，加PBS溶解并稀释至20ml，经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。
    （6）裂解液  15%十二烷基硫酸钠溶液，使用期限不得超过12个月。
    CTLL-2细胞  应为偏酸性、略微浑浊液体，传代后48~60小时用于重组人白介素-2生物学活性测定。
    标准品溶液的制备  取重组人白介素-2生物学活性测定的国家标准品，按使用说明书复溶后，用基础培养液稀释至每1ml含200IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
    供试品溶液的制备  将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释成每1ml约含200IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
    测定法  CTLL-2细胞用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养至足够量，离心收集CTLL-2细胞，用RPMI 1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液中配制成每1ml含6.0×105个细胞的细胞悬液，于37℃、5%二氧化碳条件下备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬液50μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养18~24小时；然后每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养4~6小时后，每孔加入裂解液150μl，于37℃、5%二氧化碳条件下保温18~24小时。以上操作均在无菌条件下进行。混匀细胞板中的液体，放人酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
    试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果：
                                  Ds×Es    
    供试品生物学活性（IU/ml）=Pr× ———————
                                   Dr×Er
    式中  Pr为标准品生物学活性，IU/ml；
    Ds为供试品预稀释倍数；
    Dr为标准品预稀释倍数；
    Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
    Er为标准品半效量的稀释倍数。
    注：显色方法也可采用经等效验证的其他显色方法。