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3417 无细胞百日咳疫苗鉴别试验

来源:三部   分类:三部通则   页码:510  
3417 无细胞百日咳疫苗鉴别试验
(酶联免疫法) 本法系采用联免疫法测定无细胞百日咳疫苗有效组分百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)。 试剂 (1)包被液(pH9.6碳酸盐缓冲液) 称取碳酸钠1.59g,碳酸氢钠2.93g,加水溶解,定容至1000ml。 (2)磷酸盐缓冲液(pH7.4) 称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至1000ml,121℃灭菌15分钟。 (3)洗涤液(PBS-Tween20) 量取聚山梨酯20(Tween20)0.5ml,加磷酸盐缓冲液稀释至1000ml。 (4)封闭液 称取牛血清白蛋白1.0g,加洗涤液溶解并稀释至100ml。 (5)稀释液 称取牛血清白蛋白0.5g,加洗涤液溶解并稀释至100ml。 (6)底缓冲液(0.005mol/L醋酸钠-枸橼酸缓冲液) 称取醋酸钠0.68g、枸橼酸(C6H8O7•H2O)1.05g,加水溶解并稀释至1000ml,调pH值至3.6。 (7)底物液A 称取3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)0.08g,加二甲基亚砜40ml溶解,加甲醇60ml,混匀,加底缓冲液100ml,避光搅拌2小时至完全溶解,室温静置4小时后使用。 (8)底物液B 量1.5%过氧化氢溶液3.2ml,加底物缓冲液稀释至1000ml。 (9)底物液 取底物液A底物液B等体积混匀,临用前配制。 (10)终止液 2mol/L硫酸溶液。 阳性对照的制备 用纯化的PT或FHA参考品作阳性对照(2~8μg/ml)。 阴性对照的制备 用PBS或其他适对照品作阴性对照。 供试品溶液的制备 取疫苗供试品适量,加枸橼酸钠或其他适宜试剂进行疫苗解吸附处理。 测定法 分别取PT抗体或FHA抗体(2~5μg/ml)适量,以100μl/孔加至酶标板内,用封口膜封好,2~8℃放置16~20小时;用洗涤液洗板3次,以200μl/孔加封闭液至酶标板内,用封口膜封好,37℃放置1小时;将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次,以100μl/孔加PT或FHA阳性对照供试品溶液,37℃放置1小时;用洗涤液洗板6次,稀释辣根过氧化物酶标记的PT抗体或FHA抗体至适当浓度,以100μl/孔加至酶标板内,用封口膜封好,37℃放置1小时;用洗涤液洗板6次,以100μl/孔加入底物液,室温避光放置5~15分钟;以50μl/孔加入终止液终止反应,用酶标仪在适宜波长处测定吸光度。 结果判定 Cutoff值为阴性对照吸光度的2.1倍,阳性对照的吸光度应大于Cutoff值。 供试品溶液的吸光度大于Cutoff值者为阳性。

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