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3410 抗补体活性测定法

来源:三部   分类:三部通则   页码:506  
3410 抗补体活性测定法
本法系采用免疫溶血反应作指示系统,根据供试品消耗补体所反映出的溶血率变化,测定供试品的抗补体活性。 试剂 (1)镁-钙贮备液 称取氯化钙1.103g、氯化镁(MgCl2.6H20)5.083g,加水溶解并稀释至25ml。 (2)巴比妥缓冲液贮备液 称取氯化钠41.5g、巴比妥钠5.1g ,加水800ml溶解。用1mol/L盐酸溶液调pH值至7.3,加镁-钙贮备液2.5ml,加水稀释至1000ml, 用0.22μm膜滤过,4℃保存备用。 (3)明胶巴比妥缓冲液(GVB) 称取明胶0.625g,加水30ml煮沸使溶解,加巴比妥缓冲液贮备液100ml,再加水稀释至500ml,新鲜制备,当天使用。 (4)阿氏液(Alsever’s液) 称取枸橼酸0.5g、枸橼酸钠8.0g、葡萄糖20.5g、氯化钠4.2g,加水溶解并稀释至1000ml(pH6.2左右)。根据一次采羊血需要量将该溶液分装于采血瓶中,116℃蒸汽灭菌10分钟(灭菌后,尽快释放蒸汽)。放冷后置4℃冰箱保存备用。 (5)绵羊红细胞 由绵羊颈静脉无菌采集全血适量,与等体积的阿氏液混合,无菌分装,4℃保存1周后方可使用。 (6)溶血素 兔抗羊红细胞血清。 (7)豚鼠血清(补体) 取10只以上豚鼠血清,混合,4℃离心除去血细胞,分装,-70℃保存,也可冻干保存。豚鼠血清每1ml中的补体总活性应不低于100CH50。 5%羊红细胞悬液制备 取绵羊红细胞适量,用加明胶巴比妥缓冲液至少洗3次后,悬浮于适量明胶巴比妥缓冲液中。取0.2ml红细胞悬液,加至2.8ml水中,待红细胞完全溶解后照紫外-可见分光光度法(通则0401) 在波长541nm处测定吸光度,根据下列公式,将该溶液的吸光度调节至0.62±0.01(每1ml红细胞悬液含红细胞1×109个)。 溶血素滴定 按表1稀释溶血素。从1:75稀释的溶血素开始,1.0ml不同稀释度的溶血素分别与5%羊红细胞悬液1.0ml混合,37℃放置30分钟后,取0.2ml,加明胶巴比妥缓冲液1.10ml,稀释的豚鼠补体溶液(如150倍稀释补体)0.2ml,37℃放置60分钟后,以每分钟2000转离心5分钟,吸取上清液,照紫外-可见分光光度法(通则0401)在波长541nm处测定各管吸光度。每个稀释度做2管,同时再做3管未溶血对照管(明胶巴比妥缓冲液1.4ml,加5%羊红细胞悬液0.1ml),3管全溶血管(水1.4ml加5%羊红细胞悬液0.1ml),同法操作。按下式计算各管溶血率(Y),以Y值为纵坐标,以不同溶血素稀释度为横坐标作图,从而确定敏化羊红细胞所用的溶血素的稀释度。选择增加溶血素的量也不影响Y值的溶血素的稀释度,为每1ml含1个最小溶血单位(即每1ml含1MHU)。最小溶血率应在50%~70%范围,否则试验不成立。 最适敏化的羊红细胞(EA)的制备 量取每1ml含2MHU 的溶血素(A)适量,缓慢注入等体积的5%羊红细胞(E)悬液中,37℃放置15分钟后,2~8℃保存,6小时内使用。 滴定豚鼠血清中补体活性 用明胶巴比妥缓冲液适当稀释豚鼠血清,然后按表2滴定补体。以补体用量的对数对Y/(1-Y)的对数作直线回归,求出直线回归方程的截距(a)、斜率(b)和相关系数(r)。补体活性按下式计算: 抗补体活性测定 根据测得的豚鼠血清补体活性,用加明胶巴比妥缓冲液稀释成每1ml含100CH50溶液,按表3制备培养混合物。表3中静注入免疫球蛋白(IVIG)是按每1ml含50mg浓度计算的。如果IVIG的浓度不是每1ml含50mg时,则按下式计算IVIG的加量(V),然后再根据IVIG的实际取量计算明胶巴比妥缓冲液的加入量;但要保持供试品加缓冲液的总量为0.8ml。将此混合物于37℃放置60分钟后,取0.2ml加9.8m l明胶巴比妥缓冲液(50倍稀释),测定剩余补体活性。 按下式计算供试品抗补体活性。D为每1ml含80~120CH50时, 试验成立。 【附注】(1)洗红细胞时,务必将白细胞弃掉。 (2)敏化红细胞时一定要慢慢轻摇。 (3)仅允许使用澄清明胶溶液。

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