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3409 激肽释放酶原激活剂测定法

来源:三部   分类:三部通则   页码:505  
3409 激肽释放酶原激活剂测定法
本法系采用显色底物法(或显色基质法)测定供试品中激肽释放酶原激活剂(PKA)含量。 试剂 (1)0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液(含0.15mol/L氯化钠溶液,简称TNB) 称取6.06g三羟甲基氨基甲烷(Tris,分子量为121.14)及8.77g氯化钠,加适量水溶解后,用1mol/L盐酸调pH值至8.0,补加水至1000ml。 (2)2mmol/L激肽释放酶显色底物(S-2302)溶液 称取S-2302 12.5mg,加10ml水溶解。 (3)前激肽释放酶(PK) 采用适宜方法提纯PK,小体积分装,-30℃以下保存备用。 PKA标准品溶液的制备 取PKA标准品适量,用0.85%氯化钠溶液分别稀释成每1ml中含10.0IU、20.0IU、30.0IU、40.0IU、50.0IU的溶液。按每次用量,小体积分装,-30℃保存备用。用前融化(仅允许冻融1次),并用TNB稀释10倍。 供试品溶液的制备 取供试品适量,用TNB稀释10倍。 测定法 取供试品溶液20μl,加至96孔微量滴定板孔内,加PK 20~50μl,同时开动秒表计时,向每孔加PK的时间间隔应相同,将微孔滴定板振荡1分钟;加盖,于25~30℃放置30分钟后,按加PK的顺序和时间间隔向各反应孔加2mmol/L S-2302溶液20μl,振荡1分钟;加盖,于25~30℃放置15分钟后,再以同样的加液顺序和时间间隔加50%醋酸溶液20μl,振荡1分钟后,照紫外可见分光光度法(通则0401),在波长405nm处测定吸光度;同时以TNB 20~50μl代替PK 20~50μl,同法操作,作为空白对照。用PKA标准品溶液的20μl替代供试品溶液,同法操作。以PKA标准品溶液的PKA活性的对数对其相应的吸光度对数作直线回归,求得直线回归方程,计算出供试品PKA活性。 【附注】(1)每个PKA标准品溶液和供试品溶液做3孔,其中2个为测定孔、1个为对照孔,2个测定孔吸光度差值应小于0.020。 (2)每次测定可根据供试品PKA含量,适当调整PKA标准品溶液的范围。 (3)线性回归的相关系数应不低于0.99。 (4)加PK、S-2302及50%醋酸溶液时,各孔的间隔时间应相同,加液的顺序要一致,尽可能使各孔处于同一反应条件下。 (5)加PK和加S-2302溶液后的放置时间系从第一孔加液时算起。 (6)如放置温度低于25℃,应分别在两次反应过程的限定时间内于37℃放置10分钟。

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