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3404 免疫电泳法

来源:三部   分类:三部通则   页码:502  
3404 免疫电泳法
本法系将供试品通过电泳分离成区带的各抗原,然后与相应的抗体进行双相免疫扩散,当两者比例合适时形成可见的沉淀弧。将沉淀弧与已知标准抗原、抗体生成的沉淀弧的位置和形状进行比较,即可分析供试品中的成分及其性质。 试剂 (1)巴比妥缓冲液(pH8.6) 称取巴比妥4.14g与巴比妥钠23.18g,加适量水,加热使溶解,冷却至室温,再加叠氮钠0.15g,加水使溶解成1500ml。 (2)0.5%氨基黑染色剂 称取氨基黑10B 0.5g,加甲醇50ml、冰醋酸10ml与水40ml的混合液,溶解。 (3)1.5%琼脂糖溶液 称取琼脂糖1.5g,加水50ml与巴比妥缓冲液50ml,加热使溶胀完全。 (4)脱色液 量取乙醇45ml、冰醋酸5ml与水50ml,混合均匀。 (5)溴酚蓝指示液 称取溴酚蓝50mg,加水使溶解成100ml。 对照品 正常人血清或其他适宜的对照品。 供试品溶液的制备 用生理氯化钠溶液将供试品蛋白质浓度稀释成0.5%。 检查法 将1.5%琼脂糖溶液倾倒于大小适宜的水平玻板上,厚度约3mm , 静置,待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层后,于琼脂糖凝胶板负极1/3处的上下各打1孔,孔径3mm,孔距10~15mm。测定孔加供试品溶液10μl和溴酚蓝指示液1滴,对照孔加正常人血清或人血浆10μl和溴酚蓝指示液1滴。用3层滤纸搭桥和巴比妥缓冲液(电泳缓冲液)接触,100V恒压电泳约2小时(指示剂迁移到前沿)。电泳结束后,在两孔之间距离两端3~5mm处挖宽3mm槽,向槽中加入血清抗体或人血浆抗体,槽满但不溢出。放湿盒中37℃扩散24小时。扩散完毕后,用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板,以除去未结合蛋白质。将浸泡好的琼脂糖凝胶板放入0.5%氨基黑溶液染色,再用脱色液脱色至背景基本无色。用适当方法保存或复制图谱。与对照品比较,供试品的主要沉淀线应为待测蛋白质。 注意事项 (1)电泳时应有冷却系统,否则琼脂糖凝胶会出现干裂。 (2)用生理氯化钠溶液浸泡应充分,否则背景不清晰。

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