3127 单抗分子大小变异体测定法

3127 单抗分子大小变异体测定法
    （CE-SDS法）
    本法系采用十二烷基硫酸钠毛细管电泳（CE-SDS）紫外检测方法，在还原和非还原条件下，依据分子量大小，按毛细管电泳法（通则0542） ，定量测定重组单克隆抗体产品的纯度。
    毛细管电泳系统 （1）检测器紫外 检测器，波长：214nm。
    （2）毛细管 非涂层-熔融石英毛细管（内径50μm），切割至总长为31cm，有效长度为21cm。
    （3）孔塞 大小 8（100μm×800μm）。
    试剂 （1）SDS样品缓冲液 含1%SDS的0.1mol/L Tris-HCl溶液，pH9.0。
    （2）SDS凝胶分离缓冲液 含0.2%SDS缓冲液（pH8.0），含有适当的亲水性聚合物作为分子筛。
    （3）0.1mol/L盐酸溶液。
    （4）0.1mol/L氢氧化钠溶液。
    （5）2-巯基乙醇。
    （6）烷基化溶液 0.8mol/L的碘乙酰胺水溶液，可称取约74mg碘乙酰胺，加入500μ1超纯水溶解，新鲜制备，避免光照。
    （7）参比品溶液 终浓度1mg/ml。
    供试品制备
    （1）供试品溶液制备 用SDS样品缓冲液将供试品稀释至1mg/ml。样品缓冲液以相同稀释倍数稀释，为空白对照。
    （2）非还原供试品溶液制备 取供试品溶液（1mg/ml）95μl，加入0.8mol/L碘乙酰胺水溶液5μl，涡旋混匀。取空白对照95μ1，加入0.8mol/L碘乙酰胺水溶液5μl，涡旋混匀，为非还原空白对照。
    （3）还原供试品溶液制备 取供试品溶液（1mg/ml）95μl，加入2-巯基乙醇5μl，涡旋混匀。取空白对照95μl，加入2-巯基乙醇5μl，涡旋混匀，为还原空白对照。
    将供试品溶液和空白对照在68～72℃孵育，非还原供试品溶液孵育5分钟，还原供试品溶液孵育15分钟。冷却至室温后以每分钟6000转离心1分钟。从样品管中分别取出75μl至样品瓶中，立即进行分析。
    系统适应性
    （1）还原条件的系统适应性要求
    电泳图谱：参比品溶液的电泳图谱应与提供的典型电泳图谱相一致。
    分离度：糖基化重链和非糖基化重链能够明显地分辨（分离度根据实际测定数据设定）。
    参比非糖基化重链占总重链的百分比：以非糖基化重链的修正峰面积占总重链的修正峰面积的百分比计算。参比品溶液中非糖基化重链占总重链的百分比应在指定范围内（根据实际测定数据设定）。
    迁移时间：两针参比品重链迁移时间差≤1.0分钟。
    空白：空白溶液中应无干扰峰。
    （2）非还原条件的系统适应性要求
    电泳图谱：参比品溶液的电泳图谱应与提供的典型电泳图谱相一致。
    分离度：IgG主峰与片段的分离度根据实际测定数据设定。
    参比品主峰百分比：以主峰的修正峰面积占总修正峰面积的百分比计算。系统适应性溶液主峰的相对百分含量应在指定范围内。
    迁移时间：两针参比品主峰的迁移时间差≤1.0分钟。
    注：根据仪器的不同，可调节样品进样时的条件和毛细管种类，以满足系统适应性要求。
    测定法
    毛细管的预处理：0.1mol/L氢氧化钠溶液在60psi压力下冲洗3分钟，然后用0.1mol/L盐酸溶液在60psi压力下冲洗2分钟，最后用纯水在70psi压力下冲洗1分钟。每次运行前应进行。
    毛细管的预填充：SDS凝胶分离缓冲液在50psi压力下冲洗15分钟。每次运行前应进行。
    样品进样：10kV反相极性电动进样。还原样品进样30秒；非还原样品进样40秒
    分离：15kV下运行40分钟，反相极性。
    样品室温度：18～22℃。
    毛细管温度：18～22℃。
    进样顺序：参比品、样品、参比品、空白。
    结果分析
    还原条件：按面积归一化法计算，以重链、非糖基化重链和轻链的修正峰面积分别占所有修正峰面积之和的百分比分别计算重链、非糖基化重链和轻链的纯度，三者之和即为产品纯度。[注：根据样品功能决定是否包含非糖基化重链纯度]
    非还原条件：按面积归一化法计算，以IgG主峰的修正峰面积占所有修正峰面积之和的百分比计算主峰的纯度。