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3123 人免疫球蛋白中甘氨酸含量测定法
来源：三部 分类：三部通则 页码：4583123 人免疫球蛋白中甘氨酸含量测定法 本法系依据过量的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）在一定条件下和氨基酸形成稳定的衍生产物（柱前衍生），用高效液相色谱法测定衍生产物，根据衍生产物的含量计算人免疫球蛋白中甘氨酸含量。 照高效液相色谱法（通则0512）测定。 色谱条件与系统适应性 试验用十八烷基硅烷键合硅胶为基质的C18反相色谱柱，粒度4μm，内径3.9mm，柱长150mm；柱温为37℃； 以140mmol/L醋酸钠、17mmol/L三乙胺（pH5.65）、1μg/ml乙二胺四乙酸二钠为流动相A液，以100%乙腈为流动相B液，以纯水为流动相C液，流速为每分钟1.0ml，梯度洗脱32分钟（梯度表），检测波长为248nm。甘氨酸与相邻色谱峰之间分离度应大于1.5；拖尾因子（T）为0.95～1.40（甘氨酸和α-氨基丁酸峰）；RSD应不大于2.0%（甘氨酸对照品峰面积测量值）。 内标溶液的制备 精密称取α-氨基丁酸对照品0.4g，加超纯水定容至100ml。 对照品溶液的制备 （1）精密称取甘氨酸对照品2.5g，加超纯水定容至100ml。 （2）精密量取（1）项溶液1.0ml，加9.0ml1.5%磺基水杨酸，混匀静置2小时以上，以每分钟3000转离心10分钟，留取上清液备用。 （3）精密量取（2）项上清液0.4ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.6ml，分别置10ml量瓶中，用纯水定容。 （4）精密量取（3）项溶液各0.1ml，加纯水0.4ml，内标溶液0.02ml，混匀备用。 （5）精密量取（4）项溶液10μl放入衍生管中，加硼酸缓冲液（pH8～10）70μl涡旋混合，并加入20μlAQC衍生剂涡旋混合15秒，即为对照品溶液。 供试品溶液的制备 （1）精密量取供试品溶液1.0ml，加1.5%磺基水杨酸9.0ml，混匀静置2小时以上，以每分钟3000转离心10分钟，留取上清液备用。 （2）精密量取（1）项上清液1.0ml，置10ml量瓶中，用纯水定容。 （3）精密量取（2）项溶液0.1ml，加0.4ml纯水，加内标溶液0.02ml，混匀后，精密量取10μl放入衍生管中加70μl硼酸缓冲液涡旋混合并加入20μlAQC 衍生剂涡旋混合15秒，即为供试品溶液。 测定法 精密量取对照品溶液与供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图32分钟。进样量为10μl。按内标法计算。 梯度表 ----------------------------------------------------------------------------- 时间/分钟 流速/ml·min-1 A 液/% B 液/% C 液/% 曲线 ----------------------------------------------------------------------------- 起始 1.0 100 0 0 ----------------------------------------------------------------------------- 0.5 1.0 99.0 1.0 0 瞬时 ----------------------------------------------------------------------------- 18.00 1.0 95.0 5.0 0 线性 ----------------------------------------------------------------------------- 19.00 1.0 91.0 9.0 0 线性 ----------------------------------------------------------------------------- 22.00 1.0 83.0 17.0 0 线性 ----------------------------------------------------------------------------- 25.00 1.0 0 60.0 40.0 瞬时 ----------------------------------------------------------------------------- 28.00 1.0 100 0 0 瞬时 ----------------------------------------------------------------------------- 32.00 1.0 100 0 0 线性 ----------------------------------------------------------------------------- 【附注】 （1）甘氨酸含量测定应采用柱前衍生及内标法，除本法要求外，衍生剂也可选用异硫氰酸苯酯、邻苯二甲醛；内标物也可选用正缬氨酸；C18反相色谱柱的粒度也可选用5μm或亚二微米。根据液相色谱系统、C18反相色谱柱规格、衍生剂及内标物的不同可以调整相应的色谱条件。 （2）直线回归相关系数应不低于0.999。 （3）系统适应性中重复性可用其他适宜方法。 （4）本法也适用于血液制品中组氨酸和精氨酸测定，仅对照品改为相应的组氨酸或精氨酸。 （5）根据供试品的甘氨酸含量，对照品和供试品的取量可做适当调整。