3119 高分子结合物含量测定法

3119 高分子结合物含量测定法
    本法系利用高分子结合物、低分子结合物及游离多糖在不同乙醇浓度下，沉淀分离，采用紫外-可见分光光度法测定磷含量，计算高分子结合物的含量。
    试剂 （1）5mol/L氯化钠溶液 精密称定氯化钠29.22g，加水溶解并稀释至100ml，室温保存。
    （2）1.5mol/L硫酸 于1体积98%的硫酸中加入11体积的水，混匀。
    （3）2.5%钼酸铵 称取钼酸铵2.65g，加水溶解并稀释至100ml。
    （4）10%抗坏血酸 称取抗坏血酸l0g，加水溶解并稀释至100ml。
    （5）矿化试剂 硫酸与70%高氯酸等体积混合制得。
    （6）产色试剂 水、1.5mol/L硫酸、2.5%钼酸铵、10%抗坏血酸，按2：1：1：1体积比混合配制。
    （7）80μg/ml磷对照品贮备液 精密称定经100℃干燥的磷酸氢二钠0.3665g或磷酸二氢钾0.3509g，加水500ml、5mol/L硫酸溶液10ml溶解，补加水至1000ml。临用时，将贮备液做20倍稀释，即为4μg/ml磷对照品工作液。
    （8）1.0mol/L氢氧化钠溶液 称取4g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml。
    供试品溶液的制备 （1）分步沉淀 原液用生理氯化钠溶液稀释至多糖含量20～28μg/ml或成品疫苗3ml，加入5mol/L氯化钠溶液0.75ml，混匀后加入无水乙醇15ml，于-20℃冰箱放置72～96小时，以每分钟8000转4℃离心90分钟，吸取上清液为供试品溶液2；于沉淀中加入50%乙醇溶液0.5ml，加玻璃珠，混合后室温放置1小时；再加入50%乙醇溶液1.5ml，混合后室温放置2小时，然后以每分钟8000转8℃离心1小时，吸取1.8ml上清液为供试品溶液3；沉淀再加入1.0mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，混合后室温放置1小时，加水1.25ml，作为供试品溶液4。
    （2）取多糖含量20～28μg/ml的原液或成品疫苗1.0ml为供试品1。
    （3）供试品溶液的矿化 分别量取1.0ml供试品1、1.5ml供试品溶液2、0.7ml供试品溶液3、0.5ml供试品溶液4各2份；分别加入矿化试剂0.15ml，置150℃干燥1小时，然后升温至180℃干燥30分钟，再升温至250℃干燥1小时。
    测定法 量取水1.95ml，加矿化试剂50μl后加2.0ml产色试剂，混匀后置37℃水浴2小时，在波长825mn处测定吸光度，作为空白对照。
    于矿化好的供试品溶液中加水1.85ml，加产色试剂2.0ml，混匀后置37℃水浴2小时，在波长825nm处测定吸光度。
    分别量取磷对照品工作液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml于试管中，每管依次加水1.85ml、1.75ml、1.55ml、1.15ml、0.95ml；然后每管分别加入矿化试剂50μl后加2.0ml产色试剂，混匀后置37℃水浴2小时，在波长825nm处测定吸光度。
    结果计算 以磷对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度代入直线回归方程，求出磷含量。
    供试品磷含量（μg/ml）分别为：
    P1=（A1×3）/1.0
    P2=（A2×18.75）/1.5
    P3=（A3×2.0）/0.7
    P4=（A4×2.0）/0.5-（P3×10）/100
    试验有效性 80%≤P1/（P2+P3+P4）≤120%
    供试品高分子结合物含量（%）=P4（P2+P3+P4）×100
    供试品游离多糖含量（％）=［1-P4/（P2+P3+P4）］×100
    式中 P1、P2、P3、P4为供试品1，供试品溶液2，供试品溶液3，供试品溶液4的磷含量；A1、A2、A3、A4为供试品1，供试品2，供试品3，供试品4中取样矿化后的磷含量。