注射用重组链激酶

注射用重组链激酶Zhusheyong Chongzu LianjimeiRecombinant Streptokinase for Injection
    本品系由高效表达链激酶基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后获得的重组链激酶冻干制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。
    1基本要求
    生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
    2制造
    2.1工程菌菌种
    2.1.1名称及来源
    重组链激酶工程菌株系由带有链激酶基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。
    2.1.2种子批的建立
    应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。
    2.1.3菌种检定
    主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。
    2.1.3.1划种LB琼脂平板
    应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。
    2.1.3.2染色镜检
    应为典型的革兰氏阴性杆菌。
    2.1.3.3对抗生素的抗性
    应与原始菌种相符。
    2.1.3.4电镜检查（工作种子批可免做）
    应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。
    2.1.3.5生化反应
    应符合大肠杆菌生化反应特性。
    2.1.3.6链激酶表达量
    在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。
    2.1.3.7质粒检查
    该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒的相符。
    2.1.3.8目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）
    目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。
    2.2原液
    2.2.1种子液制备
    将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养。
    2.2.2发酵用培养基
    采用适宜的不含抗生素的培养基。
    2.2.3种子液接种及发酵培养
    2.2.3.1在灭菌培养基中接种适量种子液。
    2.2.3.2在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丟失率检查（通则3406）。
    2.2.4发酵液处理
    用适宜的方法收集、处理菌体。
    2.2.5初步纯化
    采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。
    2.2.6高度纯化
    经初步纯化后，采用经批准的纯化工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，加入适宜稳定剂，除菌过滤后即为重组链激酶原液。如需存放，应规定时间和温度。
    2.2.7原液检定按3.1项进行。
    2.3半成品
    2.3.1配制与除菌
    按经批准的配方配制稀释液。配制后应立即用于稀释。
    将原液用稀释液稀释至所需浓度，除菌过滤后即为半成品，保存于2~8℃。
    2.3.2半成品检定
    按3.2项进行。
    2.4成品
    2.4.1分批
    应符合“生物制品分批规程”规定。
    2.4.2分装及冻干
    应符合“生物制品分装和冻干规程”及通则0102有关规定。
    2.4.3规格
    应为经批准的规格。
    2.4.4包装
    应符合“生物制品包装规程”及通则0102有关规定。
    3检定
    3.1原液检定
    3.1.1生物学活性
    依法测定（通则3529）。
    3.1.2蛋白质含量
    依法测定（通则0731第二法）
    3.1.3比活性
    为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于9.00×10^4 IU。
    3.1.4纯度
    3.1.4.1电泳法
    依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为10%，加样量应不低于10μg，用考马斯亮蓝R250染色。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。
    3.1.4.2高效液相色谱法
    依法测定（通则0512）。色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以A相（三氟乙酸-水溶液：量取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、B相（三氟乙酸-乙腈溶液：量取1.0ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱（0~70%B相）。上样量应不低于10μg，在波长280nm处检测，以链激酶色谱峰计算的理论板数应不低于2000。按面积归一化法计算，链激酶主峰面积应不低于总面积的95.0%。
    3.1.5分子量
    依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为10%，加样量应不低于1.0μg，制品的分子质量应为47.0kD±4.7kD。
    3.1.6外源性DNA残留量
    每1支/瓶应不高于10ng（通则3407）。
    3.1.7宿主菌蛋白质残留量
    应不高于蛋白质总量的0.050%（通则3412）。
    3.1.8残余抗生素活性
    依法测定（通则3408），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。
    3.1.9细菌内毒素检查
    依法检查（通则1143），每1mg蛋白质应小于3EU。
    3.1.10等电点
    主区带应为4.6~5.6，且供试品的等电点图谱应与对照品的一致（通则0541第六法）。
    3.1.11紫外光谱
    用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至100~500μg/ml，在光路1cm、波长230~360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为277nm土3nm（通则0401）。
    3.1.12肽图
    依法测定（通则3405），应与对照品图形一致。
    3.1.13 N端氨基酸序列（至少每年测定1次）
    用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为：
    （Met）-Val-Lys-Pro-Val-Gln-Ala-Ile-Ala-Gly-Ser-Glu-Trp-Leu-Leu-Asp。
    3.2半成品检定
    3.2.1细菌内毒素检查
    依法检查（通则1143），每1mg蛋白质应小于3EU。
    3.2.2无菌检查
    依法检查（通则1101），应符合规定。
    3.3成品检定
    除水分测定、装量差异检查外，应按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余各项检定。
    3.3.1鉴别试验
    按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。
    3.3.2物理检查
    3.3.2.1外观
    应为白色或微黄色疏松体，按标示量加入灭菌注射用水后应迅速复溶为澄明液体。
    3.3.2.2可见异物
    依法检查（通则0904），应符合规定。
    3.3.2.3装量差异
    依法检查（通则0102），应符合规定。
    3.3.3化学检定
    3.3.3.1水分
    应不高于3.0%（通则0832）。
    3.3.3.2 pH值
    应为6.9~7.9（通则0631）。
    3.3.3.3渗透压摩尔浓度
    依法测定（通则0632），应符合批准的要求。
    3.3.4生物学活性
    应为标示量的80%~150%（通则3529）。
    3.3.5残余抗生素活性
    依法测定（通则3408），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。
    3.3.6无菌检查
    依法检查（通则1101），应符合规定。
    3.3.7细菌内毒素检查
    依法检查（通则1143），每1支/瓶应小于15EU。
    3.3.8异常毒性检查
    依法检查（通则1141小鼠试验法），应符合规定。
    4稀释剂
    稀释剂应为灭菌注射用水，稀释剂的生产应符合批准的要求。
    灭菌注射用水应符合本版药典（二部）的相关要求。
    5保存、运输及有效期
    于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。
    6使用说明
    应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。