重组人表皮生长因子滴眼液（酵母）

重组人表皮生长因子滴眼液（酵母）Chongzu Ren Biaopi Shengzhangyinzi Diyanye（Jiaomu）Recombinant Human Epidermal Growth Factor Eye Drops（Yeast）
    本品系由高效表达人表皮生长因子基因的酵母，经发酵、分离和高度纯化后制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。
    1基本要求
    生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
    2制造
    2.1工程菌菌种
    2.1.1名称及来源
    重组人表皮生长因子工程菌株，系由带有人工合成的人表皮生长因子基因的DNA片段整合到酵母菌染色体基因组中构建而成。
    2.1.2种子批的建立
    应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。
    2.1.3菌种检定
    主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。
    2.1.3.1划种BMG1琼脂平板
    应呈典型酵母菌菌落形态，无其他杂菌生长。
    2.1.3.2染色镜检
    在光学显微镜下观察，应形状规则，用次甲蓝染色，无死亡细胞。
    2.1.3.3筛选标志检查
    应符合该基因表型特征。
    2.1.3.4人表皮生长因子表达量
    在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。
    2.1.3.5人表皮生长因子基因稳定性检查
    涂BMG1琼脂平板，挑选至少50个克隆，用PCR检测人表皮生长因子基因，阳性率应不低于95%。
    2.2原液
    2.2.2.1种子液制备
    将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基中培养，供发酵罐接种用。
    2.2.2发酵用培养基
    采用适宜的不含任何抗生素的培养基。
    2.2.3种子液接种及发酵培养
    在灭菌培养基中接种适量种子液。在适宜温度下进行发酵，应采用经批准的发酵工艺，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶氧、补料、发酵时间等。
    2.2.4发酵液处理用适宜的方法收集上清液。
    2.2.5纯化
    采用经批准的纯化工艺进行纯化，使其达到3.1项要求，除菌过滤后即为人表皮生长因子原液。如需存放，应规定时间和温度。
    2.2.6原液检定
    按3.1项进行。
    2.3半成品
    2.3.1配制与除菌
    按经批准的配方配制稀释液，配制后应立即用于稀释。
    原液用稀释液稀释至所需浓度，除菌过滤后即为半成品，应立即分装或保存于2~8℃。
    2.3.2半成品检定
    按3.2项进行。
    2.4成品
    2.4.1分批
    应符合“生物制品分批规程”规定。
    2.4.2分装
    应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
    2.4.3规格
    应为经批准的规格。同品种用于眼内注射、眼内插入、外科手术和急救时，均不得添加防腐剂或抗氧剂或不适当的缓冲剂，且应包装于无菌容器内供一次性使用。
    2.4.4包装
    应符合“生物制品包装规程”和通则0105的有关规定。
    3检定
    3.1原液检定
    3.1.1生物学活性
    依法测定（通则3528）。
    3.1.2蛋白质含量
    依法测定（通则0731第二法）。
    3.1.3比活性
    为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于5.0×10^5 IU。
    3.1.4纯度
    3.1.4.1电泳法
    依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。
    3.1.4.2高效液相色谱法
    依法测定（通则0512）。色谱柱采用丁基硅胶烷键合硅胶为填充剂；以A相（三氟乙酸-水溶液：取0.5ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、B相（三氟乙酸-乙腈溶液：取0.5ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱（22%~37%B相）；上样量应不低于5μg，于波长280nm处检测。以人表皮生长因子色谱峰计算理论板数，应不低于500；按面积归一化法计算，人表皮生长因子主峰面积应不低于总面积的95.0%。
    3.1.5分子量
    依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15.0%，加样量应不低于1.0μg，分子质量应为5.9kD±0.59kD。
    3.1.6外源性DNA残留量
    每100μg蛋白质应不高于10ng（通则3407）。
    3.1.7宿主菌蛋白质残留量
    应不高于总蛋白质的0.1%（通则3414）。
    3.1.8甲醇含量
    甲醇含量应不高于0.002%（通则0521）。
    3.1.9等电点
    主区带应为4.0~5.0（通则0541第六法）。
    3.1.10紫外光谱
    最大吸收峰波长应为277nm±3nm（通则0401）。
    3.1.11肽图（至少每半年测定1次）
    依法测定（通则3405），应与对照品图形一致。
    3.1.12 N端氨基酸序列（至少每年测定1次）
    用氨基酸序列分析仪测定，其N端序列应为：
    Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu0
    3.1.13鉴别试验
    按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。
    3.2半成品检定
    无菌检查
    依法检查（通则1101），应符合规定。
    3.3成品检定
    3.3.1鉴别试验
    按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。
    3.3.2物理检查
    3.3.2.1外观
    应为无色澄清液体。
    3.3.2.2可见异物
    依法检查（通则0904），应符合规定。
    3.3.2.3装量
    依法检查（通则0942），应符合规定。
    3.3.3化学检定
    3.3.3.1 pH值
    应为6.9~7.3（通则0631）。
    3.3.3.2渗透压摩尔浓度
    依法测定（通则0632），应符合批准的要求。
    3.3.4生物学活性
    应为标示量的70%~200%（通则3528）。
    3.3.5无菌检查
    依法检查（通则1101），应符合规定。
    4保存、运输及有效期
    于4~25℃避光处保存和运输。自分装之日起，按批准的有效期执行。
    5说明书
    应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。