重组人粒细胞刺激因子注射液

重组人粒细胞刺激因子注射液Chongzu Ren Lixibao Cijiyinzi ZhusheyeRecombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor Injection
    本品系由高效表达人粒细胞集落刺激因子（简称人粒细胞刺激因子）基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后获得的重组人粒细胞刺激因子制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。
    1 基本要求
    生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
    2 制造
    2.1 工程菌菌种
    2.1.1 名称及来源
    重组人粒细胞刺激因子工程菌株系由带有人粒细胞刺激因子基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。
    2.1.2 种子批的建立
    应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。
    2.1.3 菌种检定
    主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。
    2.1.3.1 划种LB琼脂平板
    应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。
    2.1.3.2 染色镜检
    应为典型的革兰氏阴性杆菌。
    2.1.3.3 对抗生素的抗性
    应与原始菌种相符。
    2.1.3.4 电镜检查（工作种子批可免做）
    应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。
    2.1.3.5 生化反应
    应符合大肠杆菌生化反应特性。
    2.1.3.6 重组人粒细胞刺激因子表达量
    在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。
    2.1.3.7 质粒检查
    该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒的相符。
    2.1.3.8 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）
    目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。
    2.2 原液
    2.2.1 种子液制备
    将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养。
    2.2.2 发酵用培养基
    采用适宜的不含抗生素的培养基。
    2.2.3 种子液接种及发酵培养
    2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液。
    2.2.3.2 在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（通则3406）。
    2.2.4发酵液处理
    用适宜的方法收集、处理菌体。
    2.2.5 初步纯化
    采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。
    2.2.6 高度纯化
    经初步纯化后，采用经批准的纯化工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，加入适宜稳定剂，除菌过滤后即为重组人粒细胞刺激因子原液。如需存放，应规定时间和温度。
    2.2.7 原液检定
    按3.1项进行。
    2.3 半成品
    2.3.1 配制与除菌
    按经批准的配方配制稀释液。配制后应立即用于稀释。
    将原液用稀释液稀释至所需浓度，除菌过滤后即为半成品，保存于2～8℃。
    2.3.2半成品检定
    按3.2项进行。
    2.4 成品
    2.4.1 分批
    应符合“生物制品分批规程”规定。
    2.4.2 分装
    应符合“生物制品分装和冻干规程”及通则0102有关规定。
    2.4.3 规格
    应为经批准的规格。
    2.4.4 包装
    应符合“生物制品包装规程”及通则0102有关规定。
    3 检定
    3.1 原液检定
    3.1.1 生物学活性
    依法测定（通则3525）。
    3.1.2 蛋白质含量
    依法测定（通则3124）。
    3.1.3 比活性
    为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于6.0×107IU。
    3.1.4 纯度
    3.1.4.1 电泳法
    依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。
    3.1.4.2 高效液相色谱法
    依法测定（通则0512）。色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以A相（三氟乙酸-水溶液：量取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、B相（三氟乙酸-乙腈溶液：量取1.0ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至 1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯 度洗脱（0～70%B相）。上样量应不低于10μg，在波长214nm处检测，以粒细胞刺激因子色谱峰计算的理论板数应不低于1500。按面积归一化法计算，重组人粒细胞刺激因子主峰面积应不低于总面积的95.0%。
    3.1.5 分子量
    依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于1.0μg，制品的分子质量应为18.8kD±1.9kD。
    3.1.6 外源性DNA残留暈
    每1支/瓶应不高于10ng （通则3407）。
    3.1.7 宿主菌蛋白质残留量
    应不高于蛋白质总量的0.10% （通则3412）。
    3.1.8 残余抗生素活性
    依法测定（通则3408）。不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。
    3.1.9 细菌内毒素检查
    依法检查（通则1143），每300μg蛋白质应小于10EU。
    3.1.10 等电点
    主区带应为5.8～6.6，且供试品的等电点图谱应与对照品的一致（通则0541第六法）。
    3.1.11 紫外光谱
    用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至100～500μg/ml，在光路1cm、波长230～360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为278nm±3nm（通则0401）。
    3.1.12 肽图
    依法测定（通则3405），应与对照品图形一致。
    3.1.13	N端氨基酸序列（至少每年测定1次）
    用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为：（Met）-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Leu。
    3.2 半成品检定 
    3.2.1 细菌内毒素检查
    依法检查（通则1143），每300μg蛋白质应小于10EU。
    3.2.2 无菌检查
    依法检查（通则1101），应符合规定。
    3.3 成品检定	，
    3.3.1 鉴别试验
    按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。
    3.3.2 物理检查
    3.3.2.1 外观
    应为澄明液体。
    3.3.2.2 可见异物
    依法检查（通则0904），应符合规定。
    3.3.2.3 装量
    依法检查（通则0102），应不低于标示量。
    3.3.3 化学检定
    3.3.3.1 pH 值
    应为3.5～4.5（通则0631）。
    3.3.3.2 渗透压摩尔浓度
    依法测定（通则0632），应符合批准的要求。
    3.3.3.3 重组人粒细胞集落刺激因子含量
    依法测定（通则3124），应为标示量的90%～130%。
    3.3.4生物学活性
    应为标示量的80%～150% （通则3525）。
    3.3.5 残余抗生素活性
    依法测定（通则3408）。不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。
    3.3.6 无菌检查
    依法检查（通则1101），应符合规定。
    3.3.7 细菌内毒素检查
    依法检查（通则1143），每1支/瓶应小于10EU。
    3.3.8 异常毒性检查
    依法检查（通则1141小鼠试验法），应符合规定。
    4 保存、运输及有效期
    于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。
    5 使用说明
    应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。