注射用重组人白介素-11（酵母）

注射用重组人白介素-11（酵母）Zhusheyong Chongzu Ren Baijiesu-11 （Jiaomu）Recombinant Human Interleukin-11 for Injection （Yeast）
    本品系由高效表达人白细胞介素-11（简称人白介素-11）基因的甲醇酵母，经发酵、分离和高度纯化后获得的重组人白介素-11冻干制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。
    1 基本要求
    生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
    2 制造
    2.1 工程菌菌种
    2.1.1 名称及来源
    重组人白介素-11工程菌株系由带有人白介素-11基因的重组质粒转化的甲醇酵母菌株。
    2.1.2 种子批的建立
    种子批的建立应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定，各级种子批的传代应符合批准的要求。
    2.1.3 菌种检定
    主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。
    2.1.3.1 划种YPD平板
    应呈典型甲醇酵母集落形态，无其他杂菌生长。
    2.1.3.2 His+表型检查
    应呈His+表型，与原始菌种相符。
    2.1.3.3 电镜检查（工作种子批可免做）
    应为典型甲醇酵母形态，应无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。
    2.1.3 4 G418抗性检查
    应与原始菌株一致。
    2.1.3.5 表达物鉴定
    采用免疫印迹法检测，应与人白介素-11对照品—致。
    2.1.3.6 人白介素-11基因稳定性检查 
    涂YPD平板，挑选至少50个克隆，用聚合酶链反应检测人白介素-11基因，阳性率应不低于95%。
    2.1.3.7 人白介素-11表达量
    在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。
    2.2 原液
    2.2.1 种子液制备
    将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜培养基中培养，供发酵罐接种用。
    2.2.2 发酵用培养基
    采用适宜的不含任何抗生素的培养基。
    2.2.3 种子液接种及发酵培养
    在灭菌培养基中接种适量种子液。在适宜温度下进行发酵，应采用经批准的发酵工艺，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、通气量、补料、发酵时间等。
    2.2.4 发酵液处理
    用适宜的方法收集上清液。
    2.2.5 初步纯化
    采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。
    2.2.6 高度纯化
    经初步纯化后，采用经批准的工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，加入适宜稳定剂，除菌过滤后即为人白介素-11原液。如需存放，应规定存放温度和时间。
    2.2.7 原液检定
    按3.1项进行。
    2.3 半成品
    2.3.1 配制与除菌
    按经批准的配方配制稀释液，配制后应立即用于稀释。将原液用稀释液稀释至所需浓度，除菌过滤后即为半成品，于2～8℃保存。
    2.3.2 半成品检定
    按3.2项进行。
    2.4 成品
    2.4.1 分批
    应符合“生物制品分批规程”规定。
    2.4.2 分装及冻干
    应符合“生物制品分装和冻干规程”及通则0102有关规定。
    2.4.3规格
    0.75mg （600万U）/瓶；1.5mg（1200万U）/瓶；3mg（2400万U）/瓶。
    2.4.4 包装
    应符合“生物制品包装规程”及通则0102有关规定。
    3 检定
    3.1 原液检定
    3.1.1 生物学活性
    依法测定（通则3532）。
    3.1.2 蛋白质含量
    采用Lowry法（通则0731第二法）或高效液相色谱法（通则0512）测定。
    采用高效液相色谱法，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温30℃±5℃，供试品保存温度为2～8℃；以0.1%三氟乙酸的水溶液为流动相A液，以0.1%三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B液；流速为1.0ml/min；检测波长214nm；按下表进行梯度洗脱。
    ————————————————————————————————
    时间（分钟）  A （ % ）    B （ % ）
    --------------------------------
        0           100         0
        2           70          30
        40          30          70
        42          70          30
        50          100         0
    ————————————————————————————————
    检测法 取标准品和供试品，用流动相A复溶或稀释至相同蛋白质浓度，将供试品与标准品以相同体积分别注入液相色谱仪（进样体积不小于10μl，进样量4～6μg），按上表进行梯度洗脱。标准品溶液、供试品溶液均进样3次，记录色谱图并计算峰面积。按外标法以峰面积计算供试品中白介素-11的含量。
    3.1.3 比活性
    为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于7.0×106U。	
    3.1.4 纯度
    3.1.4.1 电泳法
    依法测定（通则0541第五法）。取供试品溶液（不进行水浴加热处理），用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。
    3.1.4.2 高效液相色谱法
    依法测定（通则0512）。色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以A相（三氟乙酸-水溶液：量取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、B相（三氟乙酸-乙腈溶液：量取1.0ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱（0～30%B相，0～2分钟；30%～70%B相，2～40分钟）。上样量约为20μg，检测波长为214nm，理论板数按人白介素-11峰计算不低于1500。按面积归一化法计算，重组人白介素-11主峰面积应不低于总面积的95.0%。
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    时间（分钟）  流动相A （%）  流动相B （ % ）
    ------------------------------------------
        0           100           0
        2           70            30
        40          30            70
        42          70            30
    ——————————————————————————————————————————
    3.1.5 分子量
    依法测定（通则0541第五法）。取供试品溶液（不进行水浴加热处理），用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于1.0μg，制品的表观分子量应与对照品的一致，经对照品分子量校正，制品的分子质量应为19.0kD±1.9kD。
    3.1.6 外源性DNA残留量
    每1支/瓶应不高于10ng （通则3407）。
    3.1.7 宿主菌蛋白质残留量
    应不高于蛋白质总量的0.05% （通则3414）。
    3.1.8 细菌内毒素检查
    依法检查（通则1143），每1支/瓶应小于10EU。
    3.1.9 等电点
    供试品的等电点图谱应与对照品的一致（通则0541第六法）。
    3.1.10 紫外光谱
    用水将供试品稀释至0.1～0.5mg/ml，在光路1cm、波长230～360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为280nm±3nm（通则0401）。
    3.1.11 肽图
    依法测定（通则3405），应与对照品图形一致。
    3.1.12 N端氨基酸序列（至少每年测定1次）
    用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为：Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Val-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala。
    3.2 半成品检定 
    3.2.1细菌内毒素检查
    依法检查（通则1143），每1支/瓶应小于10EU。
    3.2.2 无菌检查
    依法检查（通则1101），应符合规定。
    3.3成品检定
    除水分测定、装量差异、甲醇残留量检查外，应按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余各项检定。
    3.3.1 鉴别试验
    按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。
    3.3.2 物理检查
    3.3.2.1 外观
    应为白色或微黄色疏松体。
    3.3.2.2 溶液的澄清度
    取本品，按标示量加入灭菌注射用水，复溶后溶液应澄清。如显浑浊，应与1号浊度标准液（通则0902）比较，不得更浓。
    3.3.2.3 可见异物
    依法检查（通则0904），除允许有少量细小蛋白质絮状物或蛋白质颗粒外，其余应符合规定。
    3.3.2.4 装量差异
    依法检查（通则0102），应符合规定。
    3.3.3 化学检定
    3.3.3.1 水分
    应不高于3.0%（通则0832第一法）。
    3.3.3.2 pH 值
    应为6.5～7.5（通则0631）。
    3.3.3.3 渗透压摩尔浓度
    依法测定（通则0632），应符合批准要求。
    3.3.4 甘氨酸含量
    如制品中加甘氨酸，则依法测定（通则0512），应符合批准要求。
    3.3.5 蛋白质含量
    按3.1.2项进行，应为标示量的80%～120%。
    3.3.6 生物学活性
    应为标示量的80%～150% （通则3532）。
    3.3.7 无菌检查
    依法检查（通则1101），应符合规定。
    3.3.8 细菌内毒素检查
    依法检查（通则1143），每1支/瓶应小于10EU。
    3.3.9 异常毒性检查
    依法检查（通则1141小鼠试验法），应符合规定。
    3.3.10 甲醇残留量
    如工艺中使用甲醇，则依法测定（通则0521）。色谱柱采用石英毛细管柱，柱温40℃，进样口温度200℃，检测器温度250℃，顶空瓶平衡温度为85℃，平衡时间为30分钟，载气为氮气，流速为每分钟4.0ml。用水稀释甲醇标准溶液使其浓度为0.003%，分别吸取5.0ml上述标准溶液和供试品溶液顶空进样相同体积，通过比较标准品溶液和供试品溶液的峰面积判定供试品溶液甲醇含量，甲醇残留量应不高于0.003%。
    4 稀释剂	
    稀释剂应为灭菌注射用水，稀释剂的生产应符合批 准的要求。
    灭菌注射用水应符合本版药典（二部）的相关要求。
    5 保存、运输及有效期
    于2～8℃保存和运输，自生产之日起，按批准的有效期执行。
    6 使用说明
    应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。