注射用重组人白介素-2（Ⅰ）

注射用重组人白介素-2（Ⅰ）Zhusheyong Chongzu Ren Baijiesu-2 （Ⅰ）Recombinant Human Interleukin-2 （Ⅰ） for Injection
    本品系由高效表达人白细胞介素-2（Ⅰ）[简称人白介素-2（Ⅰ）]基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后获得的重组人白介素-2（Ⅰ）冻干制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。
    1 基本要求
    生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
    2 制造
    2.1 工程菌菌种
    2.1.1 名称及来源
    重组人白介素-2（Ⅰ）工程菌株系由带有人白介素-2（Ⅰ）基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株，其中人白介素-2基因序列中原125位编码半胱氨酸的序列被突变为编码丝氨酸的序列。
    2.1.2 种子批的建立
    应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。
    2.1.3 菌种检定
    主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。
    2.1.3.1 划种LB琼脂平板
    应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。
    2.1.3.2 染色镜检
    应为典型的革兰氏阴性杆菌。
    2.1.3.3 对抗生素的抗性
    应与原始菌种相符。
    2.1.3.4 电镜检查（工作种子批可免做）
    应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。
    2.1.3.5 生化反应
    应符合大肠杆菌生化反应特性。
    2.1.3.6 人白介素-2表达量
    在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。
    2.1.3.7 质粒检查
    该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒的相符。
    2.1.3.8 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）
    目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。
    2.2 原液
    2.2.1 种子液制备
    将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养。
    2.2.2 发酵用培养基
    采用适宜的不含抗生素的培养基。
    2.2.3 种子液接种及发酵培养
    2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液。
    2.2.3.2 在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（通则3406）。
    2.2.4 发酵液处理	
    用适宜的方法收集、处理菌体。
    2.2.5 初步纯化
    采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。
    2.2.6 高度纯化
    经初步纯化后，采用经批准的纯化工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，加入适宜稳定剂，除菌过滤后即为重组人白介素-2（Ⅰ）原液。如需存放，应规定时间和温度。
    2.2.7 原液检定
    按3.1项进行。
    2.3 半成品
    2.3.1 配制与除菌
    按经批准的配方配制稀释液，配制后应立即用于稀释。将原液用稀释液稀释至所需浓度，除菌过滤后即为半成品，保存于2～8℃。
    2.3.2 半成品检定
    按3.2项进行。
    2.4 成品
    2.4.1 分批
    应符合“生物制品分批规程”规定。
    2.4.2 分装及冻干
    应符合“生物制品分装和冻干规程”及通则0102有关规定。
    2.4.3 规格
    应为经批准的规格。
    2.4.4 包装
    应符合“生物制品包装规程”及通则0102有关规定。
    3 检定
    3.1 原液检定
    3.1.1 生物学活性
    依法测定（通则3524）
    3.1.2 蛋白质含量
    依法测定（通则0731第二法）。
    3.1.3 比活性
    为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于1.0×107IU。
    3.1.4 纯度
    3.1.4.1 电泳法
    依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。
    3.1.4.2 高效液相色谱法
    依法测定（通则0512）。色谱柱以适合分离分子质量为5～60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/L磷酸盐-0.1mol/L氯化钠缓冲液，pH7.0（含适宜的表面活性剂上样量应不低于20μg，在波长280nm处检测，以人白介素-2色谱峰计算的理论板数应不低于1500。按面积归一化法计算，人白介素-2主峰面积应不低于总面积的95.0%。
    3.1.5 分子量
    依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于1.0μg，制品的分子质量应为15.5kD±1.6kD。
    3.1.6 外源性DNA残留量
    每1支/瓶应不高于10ng （通则3407）。
    3.1.7 宿主菌蛋白质残留量
    应不高于蛋白质总量的0.10% （通则3412）。
    3.1.8 残余抗生素活性
    依法测定（通则3408），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.01%再进行测定。
    3.1.9 细菌内毒素检查
    依法检查（通则1143），每300万IU应小于10EU。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.0025% 再进行测定。
    3.1.10 等电点
    主区带应为6.5～7.5，且供试品的等电点图谱应与对照品的一致（通则0541第六法）。
    3.1.11 紫外光谱
    用水或生理氯化钠濬液将供试品稀释至100～500μg/ml，在光路1cm、波长230～360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为277nm±3nm（通则0401）。
    3.1.12 肽图
    依法测定（通则3405），应与对照品图形一致。
    3.1.13 N端氨基酸序列（至少每年测定1次）
    用氨基酸序列分析仪测定，N端序列为：
    （Met）-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu-Gln-Leu-Glu。
    3.2 半成品检定
    3.2.1 细菌内毒素检查
    依法检查（通则1143），每300万IU应小于10EU。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.0025% 再进行测定。
    3.2.2 无菌检查
    依法检查（通则1101），应符合规定。
    3.3 成品检定
    除水分、装量差异检查外，应按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余各项检定。
    3.3.1 鉴别试验
    按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。
    3.3.2 物理检查
    3.3.2.1 外观
    应为白色或微黄色疏松体，按标示量加入灭菌注射用水后应迅速复溶为澄明液体。
    3.3.2.2 可见异物	
    依法检查（通则0904），应符合规定。
    3.3.2.3 装量差异
    依法检查（通则0102），应符合规定。
    3.3.3 化学检定
    3.3.3.1 水分
    应不高于3.0% （通则0832）。
    3.3.3.2 pH 值
    应为6.5～7.5（通则0631）。如制品中不含SDS，则应为3.5～7.0。
    3.3.3.3 渗透压摩尔浓度
    依法测定（通则0632），应符合批准的要求。
    3.3.4 生物学活性
    应为标示量的80%～150% （通则3524）。
    3.3.5 残余抗生素活性
    依法测定（通则3408），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.01%再进行测定。
    3.3.6 无菌检查
    依法检查（通则1101），应符合规定。
    3.3.7 细菌内毒素检查
    依法检查（通则1143），每1支/瓶应小于10EU。如制品中含SDS，应将SDS浓度稀释至0.0025%再进行测定。
    3.3.8 异常毒性检查
    依法检查（通则1141小鼠试验法），应符合规定。
    3.3.9 乙腈残留量
    如工艺中采用乙腈，则照气相色谱法（通则0521）进行。色谱柱采用石英毛细管柱，柱温45℃，气化室温度150℃，检测器温度300℃，载气为氮气，流速为每分钟4.0ml。用水稀释乙腈标准溶液，使其浓度为0.0004%，分别吸取1.0ml上述标准溶液及供试品溶液顶空进样400μl，通过比较标准溶液和供试品溶液的峰面积，判定供试品溶液乙腈含量。乙腈残留量应不高于0.0004%。
    4 稀释剂
    稀释剂应为灭菌注射用水，稀释剂的生产应符合批准的要求。
    灭菌注射用水应符合本版药典（二部）的相关要求。
    5 保存、运输及有效期
    于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。
    6 使用说明
    应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。